本文關(guān)鍵詞： 調(diào)節(jié)性T細(xì)胞 樹突狀細(xì)胞 角膜移植 排斥反應(yīng) 免疫耐受 免疫抑制 混合淋巴細(xì)胞反應(yīng) 抗原特異性 過繼轉(zhuǎn)移　出處：《第四軍醫(yī)大學(xué)》2010年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】： 研究背景: 角膜移植手術(shù)是治療不可逆角膜盲的最重要手段,我國每年大約有3000例各種角膜疾病患者需要接受角膜移植手術(shù)。由于角膜赦免狀態(tài)的存在,在所有固體器官移植中,角膜移植是成功率最高的手術(shù)。即便如此,角膜移植術(shù)后植片的長期存活率并不令人滿意,排斥反應(yīng)的發(fā)生仍然無法避免。長期隨訪觀察結(jié)果表明,對于低危受體,移植后1年成功率高達(dá)90%,但10年后下降為60%～70%;而對于眼部有新生血管、嚴(yán)重化學(xué)燒傷多次移植失敗等高危病例,10年后角膜移植成功率小于35%[107]。因此,進(jìn)一步深入了解角膜移植排斥反應(yīng)的發(fā)生機制及其預(yù)防、治療方法,仍是眼科免疫領(lǐng)域的重要課題。 研究表明,調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)廣泛存在于小鼠、大鼠、人的中樞和周圍免疫系統(tǒng)中,在維持體內(nèi)的免疫平衡,抑制器官移植排斥反應(yīng)、自身免疫性疾病以及控制腫瘤的免疫治療中起著關(guān)鍵的作用。Treg細(xì)胞能夠有效抑制被某些自體抗原活化的CD4/CD8 T淋巴細(xì)胞,當(dāng)機體缺乏Treg時將會導(dǎo)致結(jié)腸炎,關(guān)節(jié)炎,實驗性腦脊髓膜炎,I型糖尿病等自身免疫性疾病;在同種異體移植模型中,也有報道Treg可抑制被供體抗原活化的CD4+效應(yīng)T細(xì)胞,延長移植物存活時間。盡管Treg已經(jīng)廣泛應(yīng)用于自身免疫性疾病、腫瘤以及器官移植的治療中,然而,在角膜移植領(lǐng)域,尤其是針對角膜移植排斥反應(yīng),使用Treg誘導(dǎo)免疫耐受延長植片存活時間的相關(guān)研究還處于起步階段,國內(nèi)外鮮有文獻(xiàn)報道。 目的和內(nèi)容 通過TGF? 2-DC體內(nèi)誘導(dǎo)Treg及Treg過繼轉(zhuǎn)移實驗,對不同來源Treg細(xì)胞的表型、細(xì)胞因子表達(dá)、體內(nèi)作用機制以及抗原特異性進(jìn)行系統(tǒng)研究,以期揭示Treg在角膜移植排斥反應(yīng)中的重要作用,進(jìn)一步深入了解角膜移植排斥反應(yīng)中Treg的作用機制,為臨床有效調(diào)控、治療角膜移植排斥反應(yīng)及其他自身免疫性疾病提供重要的理論依據(jù)。 方法 1.Balb/c小鼠骨髓來源DC在含TGF-?2的培養(yǎng)液中培養(yǎng),與供體來源(C57BL/6小鼠)的可溶性抗原共孵育后分離純化。實驗動物分別給予PBS,2×106 TGFβ2-DC尾靜脈注射,7天后采用免疫磁珠方法分離純化脾臟來源的表型為CD4+CD25+的Treg細(xì)胞。FACS分析不同來源Treg細(xì)胞表型和細(xì)胞因子水平;RT-PCR檢測Foxp3的表達(dá)。MLR檢測不同來源Treg在體外對活化CD4+CD25-T細(xì)胞增殖反應(yīng)抑制情況,ELISA檢測Treg對活化T細(xì)胞細(xì)胞因子水平的調(diào)節(jié)作用。 2.分離純化正常小鼠來源Treg(nTreg)或TGFβ2-DC誘導(dǎo)的Treg(iTreg),Balb/c小鼠分別給予PBS,106 Treg靜脈注射,3天后進(jìn)行小鼠同種異體角膜移植術(shù)(C57BL/6小鼠)。移植后不同時間點手術(shù)顯微鏡下觀察植片存活時間及排斥曲線,移植后3天收集受體脾臟,FACS分析活化CD4+ T淋巴細(xì)胞數(shù)量、表型變化及T細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子的表達(dá);MLR檢測淋巴細(xì)胞增殖情況;ELISA檢測淋巴細(xì)胞分泌IL-2, IL-10, IFN-γ及TGF-β水平;采用特定中和性抗體(anti-IL-10、anti-TGF-β)拮抗抑制性細(xì)胞因子,觀察Treg抑制作用的具體機制。 3.天然Treg或TGFβ2-DC誘導(dǎo)Treg免疫后的Balb/c小鼠接受C57BL/6小鼠來源的或無關(guān)第三方(C3H)小鼠來源的同種異體角膜移植術(shù),移植后3天取受體脾臟T細(xì)胞為效應(yīng)細(xì)胞,分別以C57BL/6、C3H小鼠脾細(xì)胞為刺激細(xì)胞,同時加入Treg共孵育。[3H]-TdR摻入法檢測細(xì)胞增殖情況。 結(jié) 1.TGF-β2 DC注射后能提高小鼠脾臟中CD4+CD25+T細(xì)胞的表達(dá)數(shù)量(P0.05);其中CD25、CTLA-4、+Foxp3 T細(xì)胞比例在iTreg組顯著提高,而CD28細(xì)胞比例顯著下降(P0.05)。細(xì)胞因子方面iTreg組TGF-β表達(dá)較其他兩組明顯升高,提示TGF-β2 DC誘導(dǎo)的iTreg可以促進(jìn)TGF-β的分泌。nTreg和iTreg組IL-10表達(dá)較CD25-T細(xì)胞組顯著升高(P0.05)�；旌狭馨图�(xì)胞培養(yǎng)(MLR)結(jié)果顯示,iTreg對效應(yīng)T細(xì)胞增殖反應(yīng)的抑制較其他組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。 2.天然Treg免疫抑制作用以細(xì)胞接觸機制為主,獲得性Treg兼顧了細(xì)胞接觸和抑制性細(xì)胞因子分泌兩種模式;獲得性Treg注射組分泌TGF-β的濃度水平明顯高于其他三組(P0.01),而TGF-β2 DC組TGF-β水平無明顯改變,說明增多的TGF-β來自獲得性Treg細(xì)胞,而不是DC產(chǎn)生的。 3.CD4+CD25+T細(xì)胞可以成功獲得供體抗原特異性,獲取了供體抗原特異性的獲得性Treg可以有效延緩植片排斥反應(yīng)的發(fā)生,MLR結(jié)果顯示獲得性Treg對供體抗原的抑制率(IR)為86.7%。 結(jié)論 TGF-β2 DC在體內(nèi)可以有效擴增CD4+CD25+Tregs的數(shù)量及功能,不同來源Treg在細(xì)胞表型、細(xì)胞因子分泌等方面均有所不同。經(jīng)TGF-β2 DC誘導(dǎo)產(chǎn)生、以間接方式獲取異體抗原特異性的Treg比天然Treg具有更強的抑制功能,可特異性抑制受體對供體抗原的免疫反應(yīng),可以更有效地抑制角膜移植排斥反應(yīng)。具有廣闊的臨床應(yīng)用前景。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號】：R392;R779.65

【參考文獻(xiàn)】

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2 閆峰;TGF-beta DC誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在角膜移植排斥反應(yīng)中作用的實驗研究[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2007年

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本文編號：1526582