本文關(guān)鍵詞： P100蛋白 STAT1 STAT6 免疫共沉淀 蟲熒光素酶　出處：《天津醫(yī)科大學(xué)》2009年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】： 研究目的:細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄響應(yīng)的基本機(jī)制就是信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑最終激活轉(zhuǎn)錄因子,并使相應(yīng)的基因表達(dá)和造成細(xì)胞行為的改變。JAK/STAT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑是胞內(nèi)重要的信號通路之一,其在細(xì)胞生成、分化、凋亡等生物學(xué)方面有重要的意義,而其參與的調(diào)控需要多種轉(zhuǎn)錄激活因子的參與。p100蛋白首先作為EBNA2(Epstein-Barr virus nuclear antigen 2,EB病毒細(xì)胞核抗原2)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控激活因子被發(fā)現(xiàn),研究表明p100蛋白是STAT6,STAT5的轉(zhuǎn)錄共激活因子,能增強(qiáng)其轉(zhuǎn)錄活性。STAT1與STAT6同屬于STAT家族,兩者存在高度相似性,p100是否也是STAT1的共激活因子呢?本課題對此作了研究,同時(shí)進(jìn)一步明確p100蛋白與STAT6在活細(xì)胞內(nèi)結(jié)合共定位情況,為進(jìn)一步研究p100蛋白的功能提供依據(jù)。 方法:本課題分三大部分進(jìn)行,第一部分是研究p100蛋白與STAT1或STAT6的相互結(jié)合作用。該部分從兩方面研究p100蛋白與STAT1或STAT6的相互結(jié)合作用。其一是采用GST pull down技術(shù)來研究p100蛋白與STAT1或STAT6的體外結(jié)合作用,其二采用免疫共沉淀(CO-IP)研究p100蛋白與STAT1或STAT6的體內(nèi)結(jié)合作用;第二部分是采用蟲熒光素酶報(bào)告基因檢測p100蛋白及其片段調(diào)控STAT1或STAT6的轉(zhuǎn)錄活性;第三部分是觀察p100蛋白及其片段與STAT6的定位觀察。首先構(gòu)建以綠色或紅色熒光蛋白為報(bào)告基因的重組質(zhì)粒pEGFP-CI-STAT6和pERFP-CI-STAT6,其次轉(zhuǎn)染入HeLa細(xì)胞,經(jīng)刺激后在激光共聚焦顯微鏡下觀察融合蛋白的運(yùn)動(dòng)變化。 結(jié)果:①p100蛋白,p100-SN能夠與STAT6結(jié)合,但p100-TSN不能與STAT6結(jié)合。p100不能與STAT1結(jié)合。②蟲熒光素酶檢測到p100蛋白,p100-SN能夠增強(qiáng)STAT6的基因轉(zhuǎn)錄活性,但p100-TSN不能夠增強(qiáng)STAT6的基因轉(zhuǎn)錄活性。p100不能夠增強(qiáng)STAT1的基因轉(zhuǎn)錄活性。③成功構(gòu)建質(zhì)粒pEGFP-CI-STAT1和pERFP-CI-STAT6,并能夠在HeLa細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)表達(dá)。在激光共聚焦顯微鏡下觀察到p100蛋白,p100-SN蛋白能夠在IL-4刺激下與STAT6共同進(jìn)入核內(nèi),而p100-TSN不能相應(yīng)的進(jìn)入核內(nèi)。 結(jié)論①p100蛋白及其SN片段能夠與STAT6結(jié)合,并能夠增強(qiáng)STAT6的轉(zhuǎn)錄活性,而且呈劑量依賴性,TSN片段不能與STAT6結(jié)合,亦不能影響STAT6基因轉(zhuǎn)錄活性;p100蛋白不能與STAT1結(jié)合,且不能影響其轉(zhuǎn)錄活性。②成功構(gòu)建重組質(zhì)粒pEGFP-CI-STAT6和pERFP-CI-STAT6,并實(shí)現(xiàn)其在細(xì)胞中的表達(dá)。在激光共聚焦顯微鏡下觀察在活細(xì)胞狀態(tài)下蛋白的運(yùn)動(dòng)情況,在IL-4刺激下,STAT6和p100蛋白能夠進(jìn)入核內(nèi),p100-SN和STAT6也在同樣的條件下進(jìn)入核內(nèi),提示它們在細(xì)胞內(nèi)存在共定位。而在IL-4刺激下,p100-TSN不能相應(yīng)的進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi),提示與STAT6不存在共定位。③在IL-4長時(shí)間刺激下,可見到STAT6在細(xì)胞核內(nèi)聚集成顆粒狀物質(zhì),具體原因與機(jī)制有待進(jìn)一步研究。
[Abstract]:Objective: the basic mechanism of transcriptional response to intracellular signal transduction is that signal transduction pathways ultimately activate transcription factors. It also makes the corresponding gene expression and changes in cell behavior. JAK / stat signal transduction pathway is one of the important intracellular signaling pathways, which plays an important role in cell generation, differentiation, apoptosis and other biological aspects. The regulation of p100 requires the involvement of many transcriptional activators. P100 protein is first found as the transcription activator of EBNA2(Epstein-Barr virus nuclear antigen 2 Epstein-Barr virus (Epstein-Barr virus Nuclear Antigen 2). Studies have shown that p100 protein is the transcription co-activator of STAT6 and STAT5. STAT1 can enhance its transcriptional activity. STAT1 and STAT6 belong to the STAT family. Is there a high similarity between them? is p100 also a co-activator of STAT1? In this study, the co-localization of p100 protein and STAT6 in living cells was further determined, which provided the basis for further study of the function of p100 protein. Methods: the subject was divided into three parts. The first part is to study the interaction between p100 protein and STAT1 or STAT6. In this part, the interaction between p100 protein and STAT1 or STAT6 is studied from two aspects. One is to use GST pull down technique to study the in vitro binding of p100 protein to STAT1 or STAT6. The binding of p100 protein to STAT1 or STAT6 was studied by co-immunoprecipitation in vivo, and the transcriptional activity of STAT1 or STAT6 was detected by luciferase reporter gene. The third part was to observe the localization of p100 protein and its fragment with STAT6. Firstly, the recombinant plasmids pEGFP-CI-STAT6 and pERFP-CI-STAT6 with green or red fluorescent protein as reporter gene were constructed, and then transfected into HeLa cells. The motor changes of fusion protein were observed under confocal laser microscope after stimulation. Results p100-SN could bind to STAT6, but p100-TSN could not bind to STAT6. P100 could not bind to STAT1. 2 luciferase assay showed that p100-SN could enhance the transcriptional activity of STAT6. However, p100-TSN could not enhance the transcriptional activity of STAT6. P100 could not enhance the transcriptional activity of STAT1. 3. The plasmids pEGFP-CI-STAT1 and pERFP-CI-STAT6 were successfully constructed and expressed in HeLa cells. P100 protein p100-SN eggs were observed under confocal laser microscope. White can enter the nucleus together with STAT6 under the stimulation of IL-4. However, p100-TSN could not enter the nucleus. Conclusion p100 protein and its SN fragment can bind to STAT6 and enhance the transcriptional activity of STAT6. Moreover, in a dose-dependent manner, the p100 protein can neither bind to STAT6 nor affect the transcriptional activity of STAT6 gene. The recombinant plasmids pEGFP-CI-STAT6 and pERFP-CI-STAT6 were successfully constructed, and their expression was realized. The movement of proteins in living cells was observed under confocal laser microscope. Under the same conditions, STAT6 and p100 proteins could enter the nucleus under the same conditions, suggesting that they were co-located in the cell, but under the stimulation of IL-4, p100-TSN could not enter the nucleus. It is suggested that there is no co-localization with STAT6. 3. Under the stimulation of IL-4 for a long time, it can be seen that STAT6 aggregates into granular substance in the nucleus. The specific reason and mechanism need to be further studied.
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號】：R346

【共引文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 陳蘭英,趙楨,王曉濤,屈二軍,陳建南;HSP70基因在人胃癌、食道癌及宮頸癌中高表達(dá)和癌變關(guān)系的研究[J];癌變.畸變.突變;2005年04期

2 程烽;盛燕;施靜藝;陳漪;徐潮;劉智;梁軍;潘春明;朱忠勇;宋懷東;;重疊延伸PCR法構(gòu)建UGRP1基因啟動(dòng)子的點(diǎn)突變表達(dá)載體[J];癌變.畸變.突變;2007年01期

3 溫居一;張積仁;李鵬;張軍;王斌;;NADH對二乙基亞硝胺所致L02人肝細(xì)胞株p53基因突變和c-erbB2基因表達(dá)的影響[J];癌變.畸變.突變;2009年05期

4 金藝鳳;李鐵臣;王瑩;劉東華;孫珍貴;;ERCC1和XPD單核苷酸多態(tài)性與非小細(xì)胞肺癌鉑類化療敏感性的關(guān)系[J];癌變·畸變·突變;2010年05期

5 王繼英;武英;郭建鳳;呼紅梅;張印;;萊蕪黑豬保種群促卵泡素β亞基和雌激素受體基因、基因型變化情況[J];山東農(nóng)業(yè)科學(xué);2007年01期

6 陳靜;胡曉輝;苗華榮;張建成;禹山林;;花生SRAP-PCR技術(shù)體系的優(yōu)化[J];山東農(nóng)業(yè)科學(xué);2008年05期

7 陳長寶;朱樹華;周杰;;改良CTAB法提取成熟肥城桃果實(shí)的總RNA[J];山東農(nóng)業(yè)科學(xué);2009年05期

8 葛宏華,肖亞中,姚建平;人心室肌球蛋白輕鏈1基因的克隆及其體外的表達(dá)與純化[J];安徽大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版);2004年06期

9 侯新東;盛桂蓮;張樺;臘萍;;質(zhì)粒DNA提取方法的探討[J];安徽農(nóng)學(xué)通報(bào);2006年13期

10 朱美霞,孟艷玲,陳良兵;大豆與棉花抗性基因類似物的同源性比較及其進(jìn)化分析[J];安徽農(nóng)業(yè)科學(xué);2005年02期

相關(guān)會(huì)議論文 前10條

1 朱林;江昌俊;葉愛華;李葉云;余梅;鄧威威;;茶樹ATP硫化酶和硒半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶基因植物表達(dá)載體的構(gòu)建[A];現(xiàn)代農(nóng)業(yè)理論與實(shí)踐——安徽現(xiàn)代農(nóng)業(yè)博士科技論壇論文集[C];2007年

2 徐波;張莉;李啟云;王景會(huì);姜媛媛;楊貞耐;;牛凝乳酶成熟肽基因在大腸桿菌中的表達(dá)[A];中國奶業(yè)協(xié)會(huì)年會(huì)論文集2008（下冊）[C];2008年

3 劉冬光;廖娟紅;于清龍;陳穎鈺;陳煥春;郭愛珍;;融合蛋白Rv3872/CFP-10/ESAT-6的制備及在牛結(jié)核診斷中的初步應(yīng)用[A];中國奶業(yè)協(xié)會(huì)年會(huì)論文集2009（上冊）[C];2009年

4 張海龍;田兆豐;董志;張晏如;張飛云;;多花黑麥草斑駁病毒外殼蛋白基因在大腸桿菌中的表達(dá)[A];2010植物免疫機(jī)制研究及其調(diào)控研討會(huì)論文集[C];2010年

5 閆云君;蔡勇;楊江科;;基于易錯(cuò)POR技術(shù)的短小芽胞桿菌(Bacillus pumilus)脂肪酶YZO2的定向進(jìn)化[A];節(jié)能環(huán)保 和諧發(fā)展——2007中國科協(xié)年會(huì)論文集（一）[C];2007年

6 李玫;廖寶文;;紅樹林濕地烷烴降解菌的分離篩選[A];第十三屆中國科協(xié)年會(huì)第16分會(huì)場-沿海生態(tài)建設(shè)與城鄉(xiāng)人居環(huán)境學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2011年

7 郭奕斌;陳路明;孟亞仙;王晶晶;杜傳書;潘敬新;;一個(gè)廣東四川家庭的IDS基因新突變[A];第六屆全國優(yōu)生科學(xué)大會(huì)論文匯編[C];2006年

8 于占東;趙雙宜;何啟偉;王翠花;牟晉華;劉春香;;抗蕪菁花葉病毒轉(zhuǎn)基因大白菜的研究[A];中國園藝學(xué)會(huì)第十屆會(huì)員代表大會(huì)暨學(xué)術(shù)討論會(huì)論文集[C];2005年

9 龔束芳;楊濤;車代弟;;偃麥草根莖非質(zhì)體蛋白質(zhì)修飾冰晶能力的觀察[A];2007年中國園藝學(xué)會(huì)觀賞園藝專業(yè)委員會(huì)年會(huì)論文集[C];2007年

10 王英;滕齊輝;曹慧;胡鋒;崔中利;;淹水和旱作水稻土中細(xì)菌群落多樣性的空間分布[A];第四次全國土壤生物和生物化學(xué)學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2007年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 徐榮燕;嗜熱真菌糖苷酶的基因克隆、表達(dá)與分子改造[D];山東農(nóng)業(yè)大學(xué);2010年

2 殷慧群;豬誘導(dǎo)性多潛能干細(xì)胞的建立[D];安徽農(nóng)業(yè)大學(xué);2010年

3 楊瑞梅;單鏈抗體介導(dǎo)狂犬病毒shRNA靶向制劑的研究[D];甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué);2010年

4 宋翠平;H5N1禽流感和鵝Ⅰ型副粘病毒分離株的生物學(xué)特性及感染性的研究[D];中國海洋大學(xué);2010年

5 郭新軍;擬黑多刺蟻肌細(xì)胞增強(qiáng)因子2與肌鈣蛋白Ⅰ亞基基因的克隆及其在發(fā)育中的表達(dá)研究[D];陜西師范大學(xué);2010年

6 生書晶;何首烏芪合酶基因（FmSTS）的克隆、鑒定及轉(zhuǎn)化擬南芥研究[D];華南理工大學(xué);2010年

7 梁東;蘋果山梨醇代謝相關(guān)基因的分子特性研究[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2010年

8 朱彥濤;甘藍(lán)型油菜Polima CMS和陜2A CMS的形態(tài)和生化特征及其胞質(zhì)遺傳物質(zhì)的比較研究[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2010年

9 溫武軍;鯉抗菌肽基因的克隆及其功能研究[D];山東師范大學(xué);2011年

10 王秀娟;嗜熱真菌纖維二糖水解酶（CBHⅠ、CBHⅡ）和內(nèi)切葡聚糖酶（EGⅠ）的分子改造[D];山東農(nóng)業(yè)大學(xué);2011年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 高紅梅;ETEC對斷奶腹瀉仔豬胃腸道緊密連接蛋白ZO-1的影響[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2010年

2 王樹云;斑點(diǎn)叉尾洶病毒ORF6和ORF10基因的原核表達(dá)及其功能的初步研究[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2010年

3 汪艷杰;水稻polycomb基因家族甲基化狀態(tài)初步檢測[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2010年

4 王偉;惡臭假單胞菌表面展示細(xì)菌漆酶及對染料的脫色性能[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2010年

5 黃輝;哈維弧菌表面抗原的克隆和真核表達(dá)[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2010年

6 段龍川;產(chǎn)毒素多殺性巴氏桿菌重組沙門氏菌基因工程疫苗的研究[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2010年

7 龔瑞;粘附素ClfA和Cna對金黃色葡萄球菌乳腺炎的免疫保護(hù)研究[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2010年

8 劉源;豬胸膜肺炎放線桿菌雙組分調(diào)控系統(tǒng)ΔnarQ/narP突變株構(gòu)建及功能研究[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2010年

9 李善文;蟾蜍靈對大鼠腎小球系膜細(xì)胞增殖及凋亡的影響[D];南京醫(yī)科大學(xué);2009年

10 辛寧;PDX-1真核表達(dá)載體構(gòu)建及其在大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中的表達(dá)[D];鄭州大學(xué);2010年

，

本文編號：1522598