本文關鍵詞： 神經(jīng)前體細胞 貼壁培養(yǎng) 接種密度 誘導分化　出處：《大連醫(yī)科大學》2008年碩士論文　論文類型：學位論文

【摘要】： 背景:脊髓損傷(SCI)是骨科的多發(fā)病之一,后果嚴重,預后差,如何有效治療一直是臨床上的難題。隨著神經(jīng)細胞體外培養(yǎng)的成功,外源性神經(jīng)細胞移植治療SCI成為了研究的熱點。供體細胞的選擇是移植的第一步。近年來,隨著對譜系限制性神經(jīng)前體細胞進一步的研究,使其成為了供體細胞的良好選擇。然而,目前對于譜系限制性神經(jīng)前體細胞的貼壁培養(yǎng)技術仍無系統(tǒng)研究。本實驗研究的譜系限制性神經(jīng)前體細胞來源于胎鼠脊髓神經(jīng)前體細胞(NPC),通過比較NPC在不同接種密度下的生物學特性,旨在為NPC貼壁培養(yǎng)技術的建立提供參考。 神經(jīng)前體細胞包括神經(jīng)干細胞和譜系限制性神經(jīng)前體細胞,這些細胞均具有分化成熟的能力。神經(jīng)干細胞是神經(jīng)系統(tǒng)中最原始的細胞,具有高度分化潛能,一直是細胞移植研究領域的熱點。Cao.Q.L等研究表明,將神經(jīng)干細胞移植入成鼠的損傷脊髓后,移植的細胞只能分化成星型膠質(zhì)細胞,這是因為損傷后的脊髓微環(huán)境不支持神經(jīng)干細胞向神經(jīng)元方向分化。近年來,Han S.S.等研究發(fā)現(xiàn)這種微環(huán)境卻允許神經(jīng)元限制性前體細胞(NRP)和膠質(zhì)限制性前體細胞(GRP)的存活及分化,因此譜系限制性的神經(jīng)前體細胞(NRP/GRP)作為細胞移植供體成為了新的研究熱點。 神經(jīng)前體細胞的培養(yǎng)方法有很多種,目前應用最多的是懸浮培養(yǎng)法以及貼壁培養(yǎng)法。在懸浮培養(yǎng)方式下,細胞聚集成為神經(jīng)球,增殖旺盛,培養(yǎng)的細胞逐漸純化為以神經(jīng)干細胞為主;在貼壁培養(yǎng)方式下,使NPC黏附于經(jīng)過特殊處理的培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)板上生長,其增殖能力相對較弱,但貼壁培養(yǎng)的細胞經(jīng)過逐漸純化后以NRP/GRP為主。所以NPC的貼壁培養(yǎng)近年來受到了越來越多的重視,但不同學者貼壁培養(yǎng)NPC的密度不盡相同。因此,如何改善NPC的培養(yǎng)方法,使其具有最佳的生物學活性,需要我們進一步的研究。 目的: 1.探討不同密度接種胎鼠脊髓神經(jīng)前體細胞的存活率,貼壁率,增殖率,以及移植前神經(jīng)干細胞、神經(jīng)元限制性前體細胞、膠質(zhì)限制性前體細胞的比例。 2.觀察貼壁培養(yǎng)的神經(jīng)前體細胞經(jīng)誘導后能否分化為成熟的神經(jīng)細胞。 材料和方法:取孕13.5天的SD大鼠胚胎脊髓組織,按1.25×104/cm2、2.5×104/cm2、5×104/cm2、10×104/cm2,四個不同密度接種于層粘連蛋白(20μg/ml)和多聚賴氨酸(13.3μg/ml)包被的培養(yǎng)瓶及培養(yǎng)板中,培養(yǎng)三天后: 1.分別用MTT法計算細胞存活率;用高倍鏡下計數(shù)計算貼壁率;用流式細胞儀行Brdu增殖率、Nestin、PSA-NCAM、A2B5抗體檢測。 2.培養(yǎng)3天后更換培養(yǎng)液為分化培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng),每3天換液1次,培養(yǎng)一周。 結果: 1.四個細胞密度組由低到高:MTT均值分別為0.2597、0.14535、0.076925、0.0474625;貼壁率均值分別為96.673%、95.40%、94.173%、87.708%;流式細胞儀檢測下Brdu標記陽性細胞百分率分別為58.00%、37.45%、52.80%、41.62%;Nestin陽性細胞百分率分別為4.13%、1.04%、1.97%、2.27%;PSA-NCAM抗體陽性細胞百分率分別為24.65%、40.75%、10.50%、8.65%;A2B5抗體陽性細胞百分率分別為41.55%、39.52%、6.61%、12.88%。 2.以2.5×104/cm2接種細胞后,經(jīng)胎牛血清誘導后可分化成熟,其NF-200,GFAP,Gal-C抗體陽性。 結論:細胞存活率隨接種密度的增高而降低;細胞貼壁率隨接種密度的增高而降低;細胞經(jīng)體外培養(yǎng),其增殖率與接種密度無明顯相關性;神經(jīng)干細胞所占的比例無明顯差異,譜系限制性神經(jīng)前體細胞(PSA-NCAM陽性細胞+A2B5陽性細胞)的比例以第二組為最高,達到了80%以上,并與其他組有顯著差異(p0.01)。本實驗顯示NPC適宜的種植密度為2.5×104/cm2。該組細胞經(jīng)誘導分化后可以分化成為神經(jīng)元,星形膠質(zhì)細胞及少突膠質(zhì)細胞。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：大連醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2008
【分類號】：R329

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本文編號：1522527