本文關(guān)鍵詞： 樹突狀細(xì)胞 佐劑 GST Pull Down 受體克隆表達(dá) TLR4 CD40 Lox-1 TLR2　出處：《第二軍醫(yī)大學(xué)》2009年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】： Hsp70L1是我們從人樹突狀細(xì)胞(Dendritic cell, DC)cDNA文庫中發(fā)現(xiàn)的一個新分子,與HSP70家族成員具有高度同源性。重組Hsp70L1蛋白能誘導(dǎo)DC成熟并表達(dá)IL-10p70,MIP-1α,MIP-1β,RANTES,TNF-α和IL-1β等細(xì)胞因子和趨化因子;同時具有佐劑樣效應(yīng),增強抗原特異性的細(xì)胞免疫應(yīng)答。本研究旨在發(fā)現(xiàn)并鑒定DC表面Hsp70L1蛋白相關(guān)受體,通過研究Hsp70L1與相關(guān)受體作用的分子機制來闡明其發(fā)揮佐劑效應(yīng)的原理。首先我們表達(dá)純化了GST-Hsp70L1融合蛋白,通過GST Pull-Down技術(shù),尋找能與其結(jié)合的DC膜蛋白,Western-Blot結(jié)果表明TLR2、TLR4和Lox-1能與Hsp70L1在體外結(jié)合;在此基礎(chǔ)上,通過受體表達(dá)克隆,篩選出穩(wěn)定表達(dá)HSP70蛋白家族受體CD40,CCR5,Lox-1的HEK293細(xì)胞表達(dá)株,觀察與Hsp70L1蛋白的結(jié)合情況。結(jié)果顯示TLR4和CD40能與Hsp70L1結(jié)合,CCR5和LOX-1不與HSP70L1結(jié)合;隨后研究了TLR4與Hsp70L1蛋白之間相互作用的生物學(xué)效應(yīng),結(jié)果表明: Hsp70L1可以誘導(dǎo)野生型小鼠,但不能誘導(dǎo)TLR4缺陷小鼠DC的表型改變和炎性因子TNF-α和IL-1β表達(dá),HSP70L1可以在野生小鼠模型,但不能在TLR4小鼠模型上介導(dǎo)CEA特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答增強;采用人TLR4抑制劑可以明顯抑制HSP70L1介導(dǎo)的CEA抗原負(fù)載的人DC誘導(dǎo)特異細(xì)胞免疫應(yīng)答的能力。HSP70L1與TLR4作用后的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的研究表明其活化了MAPK和NF-κB級聯(lián)信號通路。從而證實了TLR4是Hsp70L1誘導(dǎo)DC成熟表型改變和炎性因子表達(dá)以及誘導(dǎo)特異性的T細(xì)胞應(yīng)答的一個關(guān)鍵的功能受體。這些結(jié)果為Hsp70L1的免疫佐劑功能的研究提供了理論基礎(chǔ)。
[Abstract]:Hsp70L1 is a novel molecule found in human dendritic cells (DC)cDNA) library, which has high homology with members of HSP70 family. Recombinant Hsp70L1 protein can induce DC maturation and express cytokines such as IL-10p70, MIP-1 偽, MIP-1 尾, RANTESN TNF- 偽 and IL-1 尾. The aim of this study was to identify and identify the receptor associated with Hsp70L1 protein on the surface of DC, and to enhance the antigen-specific cellular immune response. By studying the molecular mechanism of the interaction of Hsp70L1 with related receptors, the mechanism of its adjuvant effect is elucidated. Firstly, we express and purify the GST-Hsp70L1 fusion protein, and then we express and purify the GST-Hsp70L1 fusion protein by GST Pull-Down technique. The results of Western-Blot showed that TLR2TLR4 and Lox-1 could bind to Hsp70L1 in vitro, and on this basis, the HEK293 cell lines expressing HSP70 family receptor CD40, CCR5, Lox-1, were screened through receptor cloning, and the results showed that TLR2TLR4 and TLR4 could bind to Hsp70L1 in vitro. The results showed that TLR4 and CD40 could bind to Hsp70L1, CCR5 and LOX-1 could not bind to HSP70L1. The biological effects of TLR4 interaction with Hsp70L1 protein were studied. The results showed that Hsp70L1 could induce wild-type mice. However, the phenotypic changes of DC and the expression of TNF- 偽 and IL-1 尾 in TLR4 deficient mice could not be induced by HSP70L1 in wild mice, but the CEA specific cellular immune response could not be enhanced in TLR4 mice. Human TLR4 inhibitor could significantly inhibit the ability of HSP70L1 mediated CEA antigen-loaded human DC to induce specific cellular immune response. Studies on the signal transduction of HSP70L1 interacting with TLR4 showed that HSP70L1 activated MAPK and NF- 魏 B cascade signaling pathway. It is confirmed that TLR4 is a key functional receptor for Hsp70L1 induced mature phenotypic changes, inflammatory factor expression and specific T cell response of DC. These results provide a theoretical basis for the study of the immune adjuvant function of Hsp70L1.
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號】：R392

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本文編號：1514473