本文關(guān)鍵詞： ZNF580 遷移 增殖 S1P MAPK 內(nèi)皮細胞　出處：《天津醫(yī)科大學》2010年碩士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：目的：研究人C2H2型鋅指蛋白新基因ZNF580在1-磷酸鞘氨醇(sphingosine1-phosphate, S1P)誘導(dǎo)的內(nèi)皮細胞遷移和增殖中的作用,為闡明ZNF580基因的功能提供新的實驗依據(jù),為腫瘤血管發(fā)生的治療提供新的可能靶點。 方法：①RT-PCR技術(shù)檢測S1P受體和ZNF580在EA.hy926內(nèi)皮細胞的表達情況。②以不同濃度(0-10μM)SIP刺激EA.hy926內(nèi)皮細胞不同時間(0-12h)后,利用半定量RT-PCR、Western blot方法檢測S1P對ZNF580表達的影響。③應(yīng)用p38mitogen-activated protein kinase(p38MAPK)信號通路特異性抑制劑SB203580預(yù)處理EA.hy926內(nèi)皮細胞1h后,半定量RT-PCR和Western blot方法研究S1P是否通過此信號通路影響ZNF580的表達。④利用pEGFP-ZNF580轉(zhuǎn)染EA.hy926內(nèi)皮細胞,獲得瞬時過表達ZNF580的EA.hy926內(nèi)皮細胞,即EA.hy926pEGFP-ZNF580;利用化學合成siRNA-ZNF580轉(zhuǎn)染EA.hy926內(nèi)皮細胞,獲得瞬時低表達ZNF580的EA.hy926內(nèi)皮細胞,即EA.hy926siRNA-ZNF580⑤細胞遷移實驗分析ZNF580對內(nèi)皮細胞遷移特性的影響。⑥MTT比色法分析ZNF580對內(nèi)皮細胞增殖活性的影響。⑦利用半定量RT-PCR、明膠酶譜方法檢測EA.hy926、EA.hy926pEGFP-ZNF580和EA.hy926siRNA-ZNF580三種細胞基質(zhì)金屬蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2, MMP-2)表達情況。⑧利用半定量RT-PCR、ELISA方法檢測EA.hy926、EA.hy926pEGFP-ZNF580和EA.hy926siRNA-ZNF580三種細胞血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)表達情況。 結(jié)果：EA.hy926內(nèi)皮細胞表達ZNF580,同時表達S1P1(edg1)、S1P3(edg3)、 S1P5(edg8)三種EDG受體,上述基因的PCR特異性擴增產(chǎn)物分別為352bp、701bp、236bp,與預(yù)期結(jié)果一致；S1P刺激EA.hy926內(nèi)皮細胞后,ZNF580mRNA和蛋白水平的表達均上調(diào),且有劑量和時間效應(yīng)。在劑量效應(yīng)中,S1P濃度為0.1μM時, ZNF580表達開始增加,當S1P濃度為0.5μM, ZNF580的表達水平達到峰值。在時間效應(yīng)中,當刺激時間為1h時,ZNF580表達開始增加,當刺激時間為4h時,ZNF580的表達水平達到峰值。與正常組比較結(jié)果均有統(tǒng)計學意義(P0.05); p38MAPK特異性信號通路抑制劑SB203580能夠抑制S1P誘導(dǎo)的ZNF580的上調(diào)作用；ZNF580基因過表達(低表達)在促進(抑制)MMP-2和VEGF的表達的同時,內(nèi)皮細胞遷移和增殖活性明顯增強(減弱)。 結(jié)論：本實驗首次確定了人臍靜脈內(nèi)皮EA.hy926細胞表達ZNF580,并初步闡明了S1P-ZNF580信號在內(nèi)皮細胞遷移和增殖過程中的作用,為深入研究人C2H2型鋅指蛋白新基因ZNF580的功能及其相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路提供了實驗基礎(chǔ)和技術(shù)平臺,為腫瘤血管發(fā)生的治療提供了新的可能靶點。
[Abstract]:Aim: to study the role of human C2H2 zinc finger protein gene ZNF580 in the migration and proliferation of endothelial cells induced by sphingosine 1-phosphate (S1P), and to provide a new experimental basis for elucidating the function of ZNF580 gene. To provide new possible targets for the treatment of tumor angiogenesis. Methods the expression of S1P receptor and ZNF580 in EA.hy926 endothelial cells was detected by 1: 1 RT-PCR. The effect of S1P on the expression of ZNF580 was detected by semi-quantitative RT-PCR- Western blot. 3. EA.hy926 endothelial cells were pretreated with p38mitogen-activated protein kinasep38 MAPK (p38mitogen-activated protein kinasep38 MAPK) signal pathway inhibitor SB203580 for 1 h. Semi-quantitative RT-PCR and Western blot methods to investigate whether S1P affects the expression of ZNF580 through this signaling pathway, pEGFP-ZNF580 was used to transfect EA.hy926 endothelial cells to obtain transient ZNF580 overexpression EA.hy926 endothelial cells, i.e., EA.hy926pEGFP-ZNF580. EA.hy926 endothelial cells were transfected with chemically synthesized siRNA-ZNF580. EA.hy926 endothelial cells with transient low expression of ZNF580 were obtained. Analysis of the effect of ZNF580 on the Proliferation of Endothelial cells by EA.hy926siRNA-ZNF5805 Cell Migration Assay ..7 the effect of ZNF580 on the Proliferation of Endothelial cells using Semi-quantitative RT-PCR, Gelatin Enzymatic Spectroscopy to detect three kinds of Cell Matrix Metalloproteins, EA.hy926pEGFP-ZNF580 and EA.hy926siRNA-ZNF580. The expression of metalloproteinase-2 (MMP-2) in EA.hy926pEGFP-ZNF580 and EA.hy926siRNA-ZNF580 cells were detected by semi-quantitative RT-PCR- Elisa method. The expression of vascular endothelial growth factor (VEGF) in EA.hy926pEGFP-ZNF580 and EA.hy926siRNA-ZNF580 was detected by RT-PCR. Results the expression of ZNF580 and S1P1P3edg3, S1P5edg8) receptors were expressed in the endothelial cells of 1: EA.hy926, respectively. The PCR specific amplification products of the above genes were 352bpti701bp2bp236bp. the expression of ZNF580 mRNA and protein were up-regulated after stimulated by S1P in EA.hy926 endothelial cells, and the expression of ZNF580mRNA and protein were up-regulated after stimulated by S1P1P, and the expression of ZNF580mRNA and protein were up-regulated by S1P1P. When the concentration of S1P was 0.1 渭 M, the expression of ZNF580 began to increase, and the expression level of ZNF580 reached its peak when the concentration of S1P was 0.5 渭 M. in the time effect, the expression of ZNF580 began to increase when the stimulation time was 1h. When the stimulation time was 4 h, the expression level of ZNF580 reached its peak. Compared with the normal group, the expression level of ZNF580 was significantly higher than that of the normal group, and the p38 MAPK specific signal pathway inhibitor SB203580 could inhibit the up-regulation of ZNF580 induced by S1P and the overexpression of ZNF580 gene (low table). In addition to inhibiting the expression of MMP-2 and VEGF, The migration and proliferation activity of endothelial cells were significantly increased (decreased). Conclusion: the expression of ZNF580 in human umbilical vein endothelial EA.hy926 cells was determined for the first time, and the role of S1P-ZNF580 signal in the process of endothelial cell migration and proliferation was preliminarily elucidated. It provides the experimental basis and technical platform for the further study of the function of human C2H2 zinc finger protein gene ZNF580 and its related signal transduction pathway, and provides a new possible target for the treatment of tumor angiogenesis.
【學位授予單位】：天津醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2010
【分類號】：R322

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本文編號：1509517