本文關(guān)鍵詞： 調(diào)節(jié)性T細(xì)胞 致耐受性樹突狀細(xì)胞 胰島移植 免疫耐受　出處：《第二軍醫(yī)大學(xué)》2009年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】： 免疫耐受的維持需要多種機(jī)制的共同參與,除了中樞耐受機(jī)制外,機(jī)體對抗原的克隆忽略以及抗原特異性T、B細(xì)胞的克隆失能和克隆清除均參與其中,另外,CD4~+CD25~+Foxp3~+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(T regulatory cell ,Treg)作為一群有抑制功能的T細(xì)胞亞群,其在維持機(jī)體穩(wěn)態(tài)中的作用也已經(jīng)得到充分的證實(shí)。在移植免疫的研究中,如何誘導(dǎo)供者特異性免疫耐受而不影響到機(jī)體對其它抗原的免疫應(yīng)答,是器官移植研究領(lǐng)域的一個(gè)熱門研究課題。 凋亡作為體內(nèi)的一種正常的生理過程,不會(huì)引起機(jī)體強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)�？赡苡腥缦聶C(jī)制參與其中,首先,吞噬細(xì)胞可以迅速的吞噬凋亡小體防止其中炎性介質(zhì)的釋放,其次,凋亡細(xì)胞可以釋放一些抗炎因子如IL-10、轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factor-β, TGF-β)等調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫反應(yīng)。因此,凋亡細(xì)胞具有負(fù)相免疫調(diào)控功能,應(yīng)用凋亡細(xì)胞預(yù)注射誘導(dǎo)移植耐受是近年來防止移植排斥一個(gè)重要策略。 根據(jù)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的來源、產(chǎn)生和發(fā)揮作用的機(jī)制可以將其分為兩大類:胸腺來源的Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞和可誘導(dǎo)的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞�？烧T導(dǎo)的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞又可以分為產(chǎn)生IL-10的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Tr1)、產(chǎn)生TGF-β的輔助性T細(xì)胞(Th3)和可誘導(dǎo)的Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞。Treg主要通過以下方式誘導(dǎo)維持免疫耐受:(1)在抗原刺激后,抗原特異性Treg可以通過趨化因子迅速的集中在抗原遞呈細(xì)胞的周圍,從而競爭性抑制抗原反應(yīng)性T細(xì)胞被抗原遞呈細(xì)胞的激活。(2)與抗原特異性Treg接觸的抗原遞呈細(xì)胞功能下調(diào),妨礙了反應(yīng)性T細(xì)胞的激活。(3)Treg可以分泌顆粒酶、穿孔素、IL-10等抑制性細(xì)胞因子。(4)Treg可以通過與反應(yīng)性T細(xì)胞競爭IL-2誘導(dǎo)其凋亡。 鑒于調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的抗原特異性抑制功能,我們不難聯(lián)想到它們是否在凋亡細(xì)胞誘導(dǎo)的移植免疫耐受中發(fā)揮作用,如果Treg在以上過程中起作用,那這部分Treg又是如何產(chǎn)生、如何發(fā)揮作用的呢。為了回答上述問題,我們對凋亡細(xì)胞誘導(dǎo)特異性免疫耐受的機(jī)制進(jìn)行了進(jìn)一步的探討。 第一部分凋亡細(xì)胞誘導(dǎo)的小鼠胰島移植免疫耐受的實(shí)驗(yàn)觀察 腹腔注射鏈脲佐菌素(streptozocin,STZ)200mg/kg建立小鼠糖尿病模型,三天后即可出現(xiàn)明顯的空腹血糖升高,血糖大于18mmol/L者可作為胰島移植的受體。用無菌Ⅴ型膠原酶(0.5mg/mL)逆行灌注胰腺,將充盈的胰腺取下38℃消化20min,用20%胎牛血清中和膠原酶后RPMI-1640洗兩遍。胰島細(xì)胞懸液與OptiPrep? 2:1混合,密度梯度離心20min后,取兩層界面之間的細(xì)胞,此為較純的胰島。鏡下觀察胰島呈圓形或卵圓形,有折光性的胞膜,大小不一。雙硫腙(DTZ)染色后呈紅色。每只小鼠可得胰島150個(gè)左右。 無菌取小鼠脾臟,研磨后40μm cell strainer過濾,低滲液Tris-NH4Cl溶解紅細(xì)胞,低速離心后沉淀重懸后即為小鼠脾細(xì)胞懸液。將分離得到的淋巴細(xì)胞調(diào)整細(xì)胞濃度至106 /ml,六孔板中每孔加入1ml淋巴細(xì)胞懸液,30w UVB紫外燈距離40cm照射10min,后將照射后的細(xì)胞置于含10%胎牛血清的RPMI-1640中培養(yǎng)6h,流式細(xì)胞儀檢測凋亡細(xì)胞比例為50-80%。 將血糖符合要求的小鼠隨機(jī)分組,設(shè)凋亡細(xì)胞注射后移植組,單純移植組,僅注射凋亡細(xì)胞組和無任何處理組。凋亡細(xì)胞預(yù)注射后移植組尾靜脈注射供體小鼠來源的凋亡細(xì)胞107 /只,一周后行胰島移植。將新鮮分離純化后的胰島200/只埋植于受體小鼠右腎包膜下。觀察各組移植后小鼠血糖及生存期的變化。結(jié)果表明,凋亡細(xì)胞預(yù)注射組小鼠的存活期(106±6天)較之對照組(13±4天)顯著延長。耐受鼠血糖由移植前的25.77±3.73mmol/L降低為12.23±4.50mmol/L。而單純注射凋亡細(xì)胞組與未行任何處理組小鼠血糖及生存期幾無差別,生存期分別為60±7天和61±9天,少于耐受組。 以上結(jié)果表明,供者來源的凋亡淋巴細(xì)胞預(yù)注射可顯著提高移植受者的生存期,減輕受體鼠的糖尿病癥狀。 第二部分凋亡細(xì)胞誘導(dǎo)的小鼠胰島移植免疫耐受的機(jī)制研究 為了研究凋亡細(xì)胞引起的供者特異性的免疫耐受,我們選取了存活期大于60天的耐受小鼠作為研究對象。首先采用FACS檢測分析了耐受鼠脾臟淋巴細(xì)胞CD4~+CD25~+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的數(shù)量。檢測結(jié)果表明,脾臟中CD4CD25雙陽性的細(xì)胞在耐受小鼠中的比例為7.5±0.6%,明顯高于正常未作移植的小鼠(3.3±0.4%)。CD4+Foxp3+調(diào)節(jié)性T的比例為(6.2±0.8%),也顯著高于對照小鼠(3.1±0.4%)。以上結(jié)果表明,凋亡誘導(dǎo)的耐受小鼠體內(nèi)確實(shí)有Treg細(xì)胞的擴(kuò)增,提示Treg在誘導(dǎo)維持耐受的過程中發(fā)揮了重要作用。 將耐受小鼠體內(nèi)的CD4CD25雙陽性的細(xì)胞用免疫磁珠分選出來后,加入供者成熟骨髓來源的樹突狀細(xì)胞(BMDC)作為刺激細(xì)胞,受體CD4~+CD25~-T細(xì)胞作為反應(yīng)細(xì)胞的混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)體系,與野生型同品系來源的CD4CD25雙陽性細(xì)胞相比,受體來源的CD4CD25雙陽性細(xì)胞可明顯抑制T淋巴細(xì)胞的體外增殖反應(yīng),采用羥基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺酯(CFSE)標(biāo)記反應(yīng)T細(xì)胞,顯示耐受鼠的CD4CD25雙陽性細(xì)胞可明顯減少反應(yīng)T細(xì)胞的分裂峰。而對于非供體來源的刺激細(xì)胞,耐受鼠Treg細(xì)胞對MLR反應(yīng)的影響與對照組相比無明顯差異。這就提示凋亡誘導(dǎo)的Treg具有更強(qiáng)的且是抗原特異性的抑制功能。 既然凋亡細(xì)胞誘導(dǎo)了特異性的Treg細(xì)胞的增殖,那這群Treg到底是如何產(chǎn)生的呢。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的抑制功能的機(jī)理有很多種解釋,但其來源仍沒有確切的答案。新生胸腺切除的小鼠幾乎無Treg細(xì)胞的產(chǎn)生,提示胸腺是Treg產(chǎn)生的重要場所;Foxp3報(bào)告基因小鼠也證實(shí)了Treg細(xì)胞在胸腺中的發(fā)育成熟。但是還有很多實(shí)驗(yàn)表明Treg細(xì)胞可在某些條件下在胸腺外產(chǎn)生,像初始T細(xì)胞在TGF-β存在的情況下被激活的話,細(xì)胞內(nèi)就會(huì)有Foxp3的表達(dá)。樹突狀細(xì)胞(DC)一直以來被看作免疫調(diào)控的中心環(huán)節(jié),近年來的實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)DC在Treg的誘生過程中同樣發(fā)揮著十分重要的作用。 為了進(jìn)一步觀察耐受小鼠DC與Treg相互作用在誘導(dǎo)移植物耐受過程中的免疫學(xué)機(jī)理。我們采用免疫磁珠法分選出耐受鼠脾臟中CD11c陽性的細(xì)胞樹突狀細(xì)胞,通過FACS檢測其表型。我們發(fā)現(xiàn)與野生型小鼠的CD11c+ DC相比,耐受鼠中的DC表面MHCⅡ類分子、CD80、CD86和CD40等共刺激分子明顯低表達(dá)而抑制性分子程序性死亡配體-1(programmed death 1 ligand , PD-L1 )高表達(dá)。這說明耐受小鼠脾臟中的DC呈現(xiàn)一種相對低的成熟狀態(tài),表現(xiàn)出致耐受性樹突狀細(xì)胞的表型特點(diǎn)。鑒于以上結(jié)果,我們推測該亞群致耐受性樹突狀細(xì)胞在Treg的分化發(fā)育中起了作用。 將免疫磁珠法分選得到的耐受小鼠脾臟中CD11c陽性的細(xì)胞與同系小鼠CD4+ CD25- T細(xì)胞1:1共孵育三天后,流式檢測T細(xì)胞的表型變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)與耐受鼠脾臟DC共孵育的CD4~+CD25~-T細(xì)胞明顯上調(diào)了Foxp3表達(dá)的細(xì)胞數(shù)(15.76±1.97%),而與野生型小鼠共孵育的T細(xì)胞表型則無明顯變化(0.15%)。在共培養(yǎng)體系中加入抗PD-L1抗體阻斷PD-L1的作用后,致耐受性樹突狀細(xì)胞的這種能力被顯著抑制,而阻斷與PD-L1共受體的分子PD-L2后轉(zhuǎn)化能力不受影響。提示PD-1/PD-L1共刺激通路參與了耐受性DC與Treg相互作用。 進(jìn)一步的研究表明,耐受小鼠體內(nèi)的CD4~+CD25~+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在體外共培養(yǎng)體系中可以誘導(dǎo)耐受性DC的產(chǎn)生。我們將耐受小鼠中分選得到的CD4~+CD25~+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞與BMDC1:1比例共孵育,三天后檢測DC表型的變化,發(fā)現(xiàn)與耐受鼠體內(nèi)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞共孵育的DC表面CD40、CD80/CD86等共刺激分子表達(dá)明顯下調(diào)。 綜上所述,凋亡細(xì)胞可以上調(diào)移植受體鼠體內(nèi)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞與耐受性樹突狀細(xì)胞的數(shù)量,同時(shí)通過調(diào)節(jié)性T細(xì)胞與耐受性樹突狀細(xì)胞相互誘生的反饋環(huán)路,促進(jìn)供者特異性移植免疫耐受的發(fā)生。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號(hào)】：R392

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本文編號(hào)：1507686