本文關(guān)鍵詞： 漢灘病毒 RNA干擾 血管內(nèi)皮細胞 Toll樣受體-4 信號轉(zhuǎn)導　出處：《第四軍醫(yī)大學》2008年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】： 漢坦病毒(Hantavirus, HV)屬于布尼亞病毒科(famly Bunyaviridae),是有包膜的單股分節(jié)段負鏈RNA病毒,基因組由L、M、S三個片段組成,分別編碼RNA聚合酶、兩種包膜糖蛋白(G1和G2)和核衣殼蛋白(NP)。HV主要引起兩種人類急性傳染病,即腎綜合征出血熱(hemorrhagic fever with renal syndrome, HFRS)和漢坦病毒心肺綜合征(hantavirus cardiopulmonary syndrome, HCPS)。其主要臨床表現(xiàn)為發(fā)熱、低血壓休克、出血和腎功能衰竭。我國是世界上受HFRS危害最為嚴重的國家,漢坦病毒屬的漢灘病毒(Hantaan virus, HTNV)是我國引起重癥HFRS的主要型別。此外,HV還是重要的生物戰(zhàn)劑,對未來的軍事活動構(gòu)成嚴重威脅。盡管自1981年我國成功分離HV以來,國內(nèi)外學者對HV及其相關(guān)疾病的臨床救治研究已取得了很大進展,但其發(fā)病的分子機理尚未完全闡明,也無特效的治療藥物。因此,探討HV感染致病的分子機制,尋找有效的抗病毒治療藥物及研制新型疫苗,一直是預防醫(yī)學和軍事醫(yī)學研究的熱點。 HV主要感染血管內(nèi)皮細胞,引起血小板減少、全身小血管和毛細血管廣泛損傷及血管內(nèi)皮細胞腫脹變性等主要病理改變。許多研究證實,HV誘導的免疫反應是內(nèi)皮細胞功能失調(diào)及HV致病的主要環(huán)節(jié),但有關(guān)免疫網(wǎng)絡及眾多細胞因子和膜分子在本病發(fā)病中的作用及相互關(guān)系仍有待深入研究。Toll樣受體(Toll-like receptors, TLR)如同天然免疫的“眼睛”,監(jiān)視與識別病原體結(jié)構(gòu)成分,啟動細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導通路,誘導特異性基因表達,分泌細胞因子/趨化因子,這是TLRs活化最重要的效應,也是機體抗感染免疫的第一道屏障。因此,以TLRs為靶位,抑制或激活TLRs表達或調(diào)控TLRs信號通路,不僅可以了解機體抗感染免疫的機制,而且還可作為藥物設計和疫苗研制的靶點。為了解TLRs介導的抗HV免疫及信號轉(zhuǎn)導機制,本研究選擇血管內(nèi)皮細胞為靶細胞,以TLR4為切入點,應用RNA干擾(RNAi)技術(shù),沉默TLR4基因功能,探討它對HV的識別及可能的信號轉(zhuǎn)導途徑,闡明血管內(nèi)皮細胞TLR介導的抗HV免疫的分子機制,為HFRS發(fā)病機理研究、抗病毒藥物設計和疫苗研制提供新的資料。 本研究的內(nèi)容和實驗結(jié)果如下: 1.HTNV感染血管內(nèi)皮細胞引起Toll樣受體變化 培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細胞系EVC-304,經(jīng)HTNV 76-118感染后,用半定量RT-PCR分別測定不同TLRs的表達情況,發(fā)現(xiàn)TLR4 mRNA水平上調(diào),而TLR3下調(diào),TLR2、TLR7、TLR9未見明顯變化。實驗中分別用TLRs的配體刺激作為陽性對照,結(jié)果與文獻報道相符。既往研究多認為TLR4是一種識別LPS的受體,但近年來的研究發(fā)現(xiàn)TLR4也可識別病毒結(jié)構(gòu)成分(病毒蛋白),本研究發(fā)現(xiàn)在HTNV感染血管內(nèi)皮細胞后可引起TLR4表達上調(diào)。 2.TLR4 siRNA表達載體的構(gòu)建及穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞系的建立 本研究選擇Ambion公司的Pol II啟動子CMV驅(qū)動的P-silencer 4.1-CMV載體。根據(jù)GenBank收錄的人TLR4(NM-138554)基因序列設計了9條siRNA相對應雙鏈DNA復合體,體外退火連接入siRNA表達載體P-silencer 4.1-CMV,克隆轉(zhuǎn)化后提取質(zhì)粒。重組載體用Hind III和BamH I酶切后經(jīng)PAGE電泳分析,得到55 bp大小的條帶,初步證實合成片段成功插入載體。DNA序列測定證實所插入的片段序列與合成序列完全一致,表明已成功構(gòu)建了針對TLR4基因的siRNA表達載體。 將9個重組質(zhì)粒(TS1~9)分別轉(zhuǎn)染EVC-304細胞后,提取mRNA,采用RT-PCR初步篩選出了5種抑制效率較高的質(zhì)粒,分別命名為TS1、TS4、TS5、TS6、TS8;其中TS4和TS6瞬時轉(zhuǎn)染的抑制效率分別達到89%和90%。將上述5種質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染EVC-304細胞,用G418篩選,建立了3株可以穩(wěn)定抑制TLR4表達的細胞系,其中TS4穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞系,其轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平的抑制效率均達98%以上。新建細胞系的形態(tài)特點及生長周期與原細胞系基本一致。 3.病毒感染后細胞因子的分泌變化與TLR4的關(guān)系 將TLR4表達陽性的細胞系EVC-304和EVC-304 TLR4-分別用HTNV感染72 h后,用ELISA試劑盒檢測細胞因子的表達水平。發(fā)現(xiàn)IFN-α、IL-8在HTNV感染前后分泌水平未見明顯差異, EVC-304和TLR4基因沉默的細胞系EVC-304 TLR4-分泌水平之間也無明顯差異; HTNV感染EVC-304細胞后,IFN-β,IL-6和TNF-α分泌增加,特別是加入LPS后增加更為明顯,而EVC-304 TLR4-細胞系在病毒感染前后變化不明顯,即使HTNV與LPS同時刺激也未見IFN-β,IL-6和TNF-α分泌量發(fā)生顯著變化。 4.HTNV感染血管內(nèi)皮細胞后引起細胞因子變化的信號轉(zhuǎn)導機制 用HTNV 76-118分別感染EVC-304和EVC-304 TLR4-細胞系48 h后,提取mRNA,通過熒光定量PCR檢測TLR4下游的關(guān)鍵接頭分子MyD88和TRIF的水平。結(jié)果顯示,EVC-304細胞TRIF轉(zhuǎn)錄水平高于EVC-304 TLR4-細胞系,而MyD88轉(zhuǎn)錄水平在二種細胞系感染HTNV 76-118后變化不顯著。Western blot對MyD88和TRIF的檢測結(jié)果表明,EVC-304細胞TRIF表達量在感染后高于未感染細胞,而EVC-304 TLR4-細胞系在感染前后未見明顯變化。 結(jié)論:①HTNV感染EVC-304細胞后引起TLR4表達上調(diào),提示HTNV可活化TLR4;②TLR4活化介導了EVC-304細胞IL-6、IFN-β及TNF-α的分泌;③TLR4活化TLR4,引起細胞因子/趨化因子的分泌的信號轉(zhuǎn)導通路可能是MyD88非依賴的TRIF途徑。本研究結(jié)果證明在HTNV感染后,TLR參與了機體的抗感染免疫和發(fā)病過程,對固有免疫的深入研究有助于全面揭示HFRS的發(fā)病機制。
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【學位授予單位】：第四軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2008
【分類號】：R392

【參考文獻】

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