本文關(guān)鍵詞： 漢灘病毒 RNA干擾 血管內(nèi)皮細(xì)胞 Toll樣受體-4 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)　出處：《第四軍醫(yī)大學(xué)》2008年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】： 漢坦病毒(Hantavirus, HV)屬于布尼亞病毒科(famly Bunyaviridae),是有包膜的單股分節(jié)段負(fù)鏈RNA病毒,基因組由L、M、S三個(gè)片段組成,分別編碼RNA聚合酶、兩種包膜糖蛋白(G1和G2)和核衣殼蛋白(NP)。HV主要引起兩種人類急性傳染病,即腎綜合征出血熱(hemorrhagic fever with renal syndrome, HFRS)和漢坦病毒心肺綜合征(hantavirus cardiopulmonary syndrome, HCPS)。其主要臨床表現(xiàn)為發(fā)熱、低血壓休克、出血和腎功能衰竭。我國是世界上受HFRS危害最為嚴(yán)重的國家,漢坦病毒屬的漢灘病毒(Hantaan virus, HTNV)是我國引起重癥HFRS的主要型別。此外,HV還是重要的生物戰(zhàn)劑,對未來的軍事活動(dòng)構(gòu)成嚴(yán)重威脅。盡管自1981年我國成功分離HV以來,國內(nèi)外學(xué)者對HV及其相關(guān)疾病的臨床救治研究已取得了很大進(jìn)展,但其發(fā)病的分子機(jī)理尚未完全闡明,也無特效的治療藥物。因此,探討HV感染致病的分子機(jī)制,尋找有效的抗病毒治療藥物及研制新型疫苗,一直是預(yù)防醫(yī)學(xué)和軍事醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)。 HV主要感染血管內(nèi)皮細(xì)胞,引起血小板減少、全身小血管和毛細(xì)血管廣泛損傷及血管內(nèi)皮細(xì)胞腫脹變性等主要病理改變。許多研究證實(shí),HV誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)是內(nèi)皮細(xì)胞功能失調(diào)及HV致病的主要環(huán)節(jié),但有關(guān)免疫網(wǎng)絡(luò)及眾多細(xì)胞因子和膜分子在本病發(fā)病中的作用及相互關(guān)系仍有待深入研究。Toll樣受體(Toll-like receptors, TLR)如同天然免疫的“眼睛”,監(jiān)視與識別病原體結(jié)構(gòu)成分,啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,誘導(dǎo)特異性基因表達(dá),分泌細(xì)胞因子/趨化因子,這是TLRs活化最重要的效應(yīng),也是機(jī)體抗感染免疫的第一道屏障。因此,以TLRs為靶位,抑制或激活TLRs表達(dá)或調(diào)控TLRs信號通路,不僅可以了解機(jī)體抗感染免疫的機(jī)制,而且還可作為藥物設(shè)計(jì)和疫苗研制的靶點(diǎn)。為了解TLRs介導(dǎo)的抗HV免疫及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制,本研究選擇血管內(nèi)皮細(xì)胞為靶細(xì)胞,以TLR4為切入點(diǎn),應(yīng)用RNA干擾(RNAi)技術(shù),沉默TLR4基因功能,探討它對HV的識別及可能的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,闡明血管內(nèi)皮細(xì)胞TLR介導(dǎo)的抗HV免疫的分子機(jī)制,為HFRS發(fā)病機(jī)理研究、抗病毒藥物設(shè)計(jì)和疫苗研制提供新的資料。 本研究的內(nèi)容和實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下: 1.HTNV感染血管內(nèi)皮細(xì)胞引起Toll樣受體變化 培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞系EVC-304,經(jīng)HTNV 76-118感染后,用半定量RT-PCR分別測定不同TLRs的表達(dá)情況,發(fā)現(xiàn)TLR4 mRNA水平上調(diào),而TLR3下調(diào),TLR2、TLR7、TLR9未見明顯變化。實(shí)驗(yàn)中分別用TLRs的配體刺激作為陽性對照,結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道相符。既往研究多認(rèn)為TLR4是一種識別LPS的受體,但近年來的研究發(fā)現(xiàn)TLR4也可識別病毒結(jié)構(gòu)成分(病毒蛋白),本研究發(fā)現(xiàn)在HTNV感染血管內(nèi)皮細(xì)胞后可引起TLR4表達(dá)上調(diào)。 2.TLR4 siRNA表達(dá)載體的構(gòu)建及穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系的建立 本研究選擇Ambion公司的Pol II啟動(dòng)子CMV驅(qū)動(dòng)的P-silencer 4.1-CMV載體。根據(jù)GenBank收錄的人TLR4(NM-138554)基因序列設(shè)計(jì)了9條siRNA相對應(yīng)雙鏈DNA復(fù)合體,體外退火連接入siRNA表達(dá)載體P-silencer 4.1-CMV,克隆轉(zhuǎn)化后提取質(zhì)粒。重組載體用Hind III和BamH I酶切后經(jīng)PAGE電泳分析,得到55 bp大小的條帶,初步證實(shí)合成片段成功插入載體。DNA序列測定證實(shí)所插入的片段序列與合成序列完全一致,表明已成功構(gòu)建了針對TLR4基因的siRNA表達(dá)載體。 將9個(gè)重組質(zhì)粒(TS1~9)分別轉(zhuǎn)染EVC-304細(xì)胞后,提取mRNA,采用RT-PCR初步篩選出了5種抑制效率較高的質(zhì)粒,分別命名為TS1、TS4、TS5、TS6、TS8;其中TS4和TS6瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的抑制效率分別達(dá)到89%和90%。將上述5種質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染EVC-304細(xì)胞,用G418篩選,建立了3株可以穩(wěn)定抑制TLR4表達(dá)的細(xì)胞系,其中TS4穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系,其轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平的抑制效率均達(dá)98%以上。新建細(xì)胞系的形態(tài)特點(diǎn)及生長周期與原細(xì)胞系基本一致。 3.病毒感染后細(xì)胞因子的分泌變化與TLR4的關(guān)系 將TLR4表達(dá)陽性的細(xì)胞系EVC-304和EVC-304 TLR4-分別用HTNV感染72 h后,用ELISA試劑盒檢測細(xì)胞因子的表達(dá)水平。發(fā)現(xiàn)IFN-α、IL-8在HTNV感染前后分泌水平未見明顯差異, EVC-304和TLR4基因沉默的細(xì)胞系EVC-304 TLR4-分泌水平之間也無明顯差異; HTNV感染EVC-304細(xì)胞后,IFN-β,IL-6和TNF-α分泌增加,特別是加入LPS后增加更為明顯,而EVC-304 TLR4-細(xì)胞系在病毒感染前后變化不明顯,即使HTNV與LPS同時(shí)刺激也未見IFN-β,IL-6和TNF-α分泌量發(fā)生顯著變化。 4.HTNV感染血管內(nèi)皮細(xì)胞后引起細(xì)胞因子變化的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制 用HTNV 76-118分別感染EVC-304和EVC-304 TLR4-細(xì)胞系48 h后,提取mRNA,通過熒光定量PCR檢測TLR4下游的關(guān)鍵接頭分子MyD88和TRIF的水平。結(jié)果顯示,EVC-304細(xì)胞TRIF轉(zhuǎn)錄水平高于EVC-304 TLR4-細(xì)胞系,而MyD88轉(zhuǎn)錄水平在二種細(xì)胞系感染HTNV 76-118后變化不顯著。Western blot對MyD88和TRIF的檢測結(jié)果表明,EVC-304細(xì)胞TRIF表達(dá)量在感染后高于未感染細(xì)胞,而EVC-304 TLR4-細(xì)胞系在感染前后未見明顯變化。 結(jié)論:①HTNV感染EVC-304細(xì)胞后引起TLR4表達(dá)上調(diào),提示HTNV可活化TLR4;②TLR4活化介導(dǎo)了EVC-304細(xì)胞IL-6、IFN-β及TNF-α的分泌;③TLR4活化TLR4,引起細(xì)胞因子/趨化因子的分泌的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可能是MyD88非依賴的TRIF途徑。本研究結(jié)果證明在HTNV感染后,TLR參與了機(jī)體的抗感染免疫和發(fā)病過程,對固有免疫的深入研究有助于全面揭示HFRS的發(fā)病機(jī)制。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號】：R392

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前8條

1 余繼海,許戈良,汪建,莢衛(wèi)東,傅斌生;人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)及鑒定[J];安徽醫(yī)學(xué);2003年05期

2 王建民，，劉蔭秋，賴西南;正常臍靜脈離體后不同時(shí)間內(nèi)皮某些物質(zhì)含量的變化[J];第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào);1995年01期

3 曾昭琳,黃建生,周少波;流行性出血熱患者各期血清腫瘤壞死因子檢測及臨床意義[J];江西醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào);2001年01期

4 熊莉娟,羅端德,李淑莉,曾令蘭;腎綜合征出血熱急性期外周血細(xì)胞因子的檢測及其臨床意義[J];臨床內(nèi)科雜志;2002年05期

5 李峻,曹中偉,張順財(cái),周康;反義Toll樣受體4表達(dá)質(zhì)粒對內(nèi)毒素刺激小鼠巨噬細(xì)胞的影響[J];復(fù)旦學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2004年03期

6 錢勇,張勵(lì);內(nèi)皮細(xì)胞生長因子和肝素對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖的影響[J];眼科研究;2003年01期

7 姚磊,盛鵬,朱德鐘;腎綜合征出血熱病毒對體外培養(yǎng)人血管內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)和ATP酶活性的影響[J];中國人獸共患病雜志;2001年04期

8 孫水林;鐘恢海;席文娜;;腎綜合征出血熱相關(guān)細(xì)胞因子研究進(jìn)展[J];中華實(shí)驗(yàn)和臨床感染病雜志(電子版);2007年04期

本文編號：1502843