本文關(guān)鍵詞： 成體干細(xì)胞 細(xì)胞培養(yǎng) 創(chuàng)傷修復(fù)　出處：《第四軍醫(yī)大學(xué)》2008年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】： 除了骨髓組織,成人外周血中也存在著如造血干細(xì)胞(HSCs)和間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)等多潛能干細(xì)胞成分。相對(duì)于骨髓的采集,外周血的干細(xì)胞采集具有供體創(chuàng)傷小、來源廣泛和自體取材無免疫排斥反應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)。近年來,循環(huán)間充質(zhì)干細(xì)胞(Peripheral Blood Mesenchymal Stem Cells,PBMSCs)和循環(huán)成纖維細(xì)胞(Circulating Fibrocytes,CF)這兩種新型的多潛能成體干細(xì)胞在人類以及其他哺乳動(dòng)物外周血中被發(fā)現(xiàn)并鑒定,它們?cè)跈C(jī)體組織器官的 正常和非正常功能活動(dòng)和創(chuàng)傷修復(fù)中發(fā)揮著重要的作用。本研究著眼于應(yīng)用成體干細(xì)胞分離技術(shù),在體外分離培養(yǎng)外周血來源的成體干細(xì)胞—循環(huán)成纖維細(xì)胞,觀察它們?cè)隗w內(nèi)和體外的細(xì)胞增殖、分化、以及與多種皮膚組織細(xì)胞的相互作用;從細(xì)胞因子調(diào)控等多方面研究其作用機(jī)理,并將其應(yīng)用于皮膚創(chuàng)傷的修復(fù)過程,為組織工程皮膚的研究開辟了新的思路,更有助于提高組織工程皮膚產(chǎn)品的臨床應(yīng)用效果。 本研究主要分為四個(gè)部分 1.人外周血來源成體干細(xì)胞的體外培養(yǎng)和鑒定 目的:通過多種方法分離人外周血單個(gè)核細(xì)胞,在不同條件下獲得CF,研究了其細(xì)胞增殖特點(diǎn)和對(duì)其進(jìn)行了詳細(xì)的鑒定。方法:采用淋巴細(xì)胞分離液(Percoll/ Ficoll)分離含有外周血單個(gè)核細(xì)胞的白細(xì)胞群,直接體外培養(yǎng)或磁珠分選法分離單個(gè)核細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng),從而獲得CF細(xì)胞;通過不同細(xì)胞因子促進(jìn)CF細(xì)胞增殖,比較效果;培養(yǎng)過程中描畫CF細(xì)胞生長曲線;應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法和流式細(xì)胞儀對(duì)體外培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行鑒定。結(jié)果:通過分離成人外周血單個(gè)核細(xì)胞的方法可以獲得純度較高的CF細(xì)胞;在培養(yǎng)過程中應(yīng)用M-csf和TPO兩種細(xì)胞因子可以促進(jìn)CF細(xì)胞的成熟和增殖;細(xì)胞生長曲線顯示經(jīng)過細(xì)胞因子的促進(jìn)作用,CF細(xì)胞在體外培養(yǎng)過程中增殖速度加快。其中合適濃度的TPO的促進(jìn)作用更為明顯且細(xì)胞轉(zhuǎn)化率低,是理想的促進(jìn)CF細(xì)胞體外增殖的作用因子;免疫組織化學(xué)鑒定結(jié)果顯示,本實(shí)驗(yàn)中體外培養(yǎng)獲得的貼壁纖維樣細(xì)胞表達(dá)CollagenⅠ且有CollagenⅠ陽性的基質(zhì)分泌。流式細(xì)胞儀鑒定結(jié)果顯示體外培養(yǎng)的細(xì)胞其表面標(biāo)志性抗原的表達(dá)隨著時(shí)間改變而不斷變化,但均符合CF細(xì)胞的特征。鑒定結(jié)果顯示獲得的細(xì)胞明確屬于CF細(xì)胞。 2.外周血來源成體干細(xì)胞在體外培養(yǎng)過程中的多向分化能力研究 目的:探討CF細(xì)胞作為一種多潛能成體干細(xì)胞其成骨、成脂和向神經(jīng)細(xì)胞分化的能力。方法:采用與雪旺細(xì)胞(Schwann cells,SCs)共培養(yǎng)以及直接添加細(xì)胞因子NGF的方法,促進(jìn)CF細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞分化,通過免疫組織化學(xué)、Western blot以及RT-PCR等方法對(duì)誘導(dǎo)的細(xì)胞進(jìn)行鑒定;以添加地塞米松(dexamethasone,100 nM);β磷酸甘油鈉(β-glycerophosphate,10 mM);維生素C/抗壞血酸(Ascorbic acid,50μM)等試劑的培養(yǎng)基對(duì)CF細(xì)胞進(jìn)行成骨誘導(dǎo),通過大體形態(tài)和茜素紅染色鑒定誘導(dǎo)的細(xì)胞;以地塞米松(dexamethasone,1μM)、0.5 mM 3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(3-isobutyl-1-methylxanthine,IBMX)、胰島素(insulin,10μg/ml)、吲哚美辛(Indomethacin,100 mM)等試劑為活性成分的成脂誘導(dǎo)液,對(duì)體外培養(yǎng)的CF細(xì)胞進(jìn)行成脂誘導(dǎo),通過大體形態(tài)和油紅O染色鑒定誘導(dǎo)的細(xì)胞。結(jié)果:免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示在兩種誘導(dǎo)條件下CF細(xì)胞均表達(dá)神經(jīng)標(biāo)志物NSE和NF-H。western blot和RT-PCR結(jié)果也顯示同樣的結(jié)果且共培養(yǎng)組的表達(dá)更強(qiáng)。成骨誘導(dǎo)結(jié)果細(xì)胞茜素紅染色顯示陽性,顯示CF細(xì)胞在一定條件下具備成骨分化能力;油紅O染色結(jié)果顯示陽性說明CF細(xì)胞可以向脂肪細(xì)胞轉(zhuǎn)化。 3.體外觀察循環(huán)成纖維細(xì)胞對(duì)皮膚組織細(xì)胞的作用影響 目的:1)二維環(huán)境下通過共培養(yǎng)的方法觀察CF細(xì)胞對(duì)皮膚組織細(xì)胞的作用影響;2)三維條件下通過體外構(gòu)建復(fù)合CF細(xì)胞的組織工程人工皮膚,觀察CF細(xì)胞對(duì)皮膚組織細(xì)胞的作用影響。方法:1)以絲裂霉素C處理體外培養(yǎng)的原代CF細(xì)胞,使其成為類滋養(yǎng)層細(xì)胞;將體外分離培養(yǎng)的真皮成纖維細(xì)胞(Fibroblasts,FBs)和皮膚角阮細(xì)胞(Keratinocytes,KCs)與制備的類滋養(yǎng)層CF直接接觸共培養(yǎng),通過直接光鏡觀察、MTT法、BrdU-ELISA摻入法、流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期以及細(xì)胞運(yùn)動(dòng)(劃痕)實(shí)驗(yàn)(Scratch assay)等手段觀察兩種皮膚組織細(xì)胞在體外的形態(tài)和增殖變化。2)體外構(gòu)建具有復(fù)合CF細(xì)胞的真皮層的組織工程人工皮膚,通過大體觀察,HE染色組織學(xué)觀察,Pan-CK免疫組織化學(xué)染色等手段研究三維環(huán)境下CF細(xì)胞對(duì)皮膚組織細(xì)胞的作用影響。結(jié)果:1)絲裂霉素C處理后的CF細(xì)胞多次傳代后基本停止增殖,經(jīng)過與皮膚組織細(xì)胞的共培養(yǎng)后逐漸死亡;與類滋養(yǎng)層CF細(xì)胞共培養(yǎng)的FBs細(xì)胞形態(tài)基本沒有明顯變化,而KCs則形態(tài)變化明顯,出現(xiàn)表皮去分化特征性的細(xì)胞形態(tài);MTT、BrdU-ELISA和流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期顯示共培養(yǎng)后的FBs增殖加快,而KCs則增值速度減慢,提示CF細(xì)胞促進(jìn)FBs的增殖作用和對(duì)KCs的抑制作用;細(xì)胞劃痕試驗(yàn)則顯示共培養(yǎng)后的FBs細(xì)胞移行能力加強(qiáng),而KCs則呈現(xiàn)相反的趨勢(shì)。2)與具有單純復(fù)合成纖維細(xì)胞真皮的對(duì)照組相比,復(fù)合有CF細(xì)胞的真皮層的組織工程皮膚體外培養(yǎng)過程中體積收縮更為明顯,提示成纖維細(xì)胞增殖加速;但與正常對(duì)照組相比,其上皮化過程不良,角化層結(jié)構(gòu)較差。 4.循環(huán)成纖維細(xì)胞參與裸鼠皮膚創(chuàng)傷修復(fù)的實(shí)驗(yàn)研究 目的:將體外分離培養(yǎng)獲得的人CF細(xì)胞通過循環(huán)途徑移植入裸鼠體內(nèi),觀察其參與皮膚組織創(chuàng)傷修復(fù)的效果。方法:建立裸鼠背部全層皮膚創(chuàng)傷模型;體外以PKH26熒光染料標(biāo)記體外培養(yǎng)的人CF細(xì)胞;鼠尾靜脈注射方法將標(biāo)記好的人CF細(xì)胞移植入裸鼠創(chuàng)傷模型體內(nèi),設(shè)立空白對(duì)照;大體觀察創(chuàng)面愈合情況,測(cè)量各組創(chuàng)面面積計(jì)算創(chuàng)面收縮率,3w左右采用抗人單克隆抗體(Pan-CK,α-SMA,Ⅷ等)對(duì)創(chuàng)傷部位皮膚組織進(jìn)行取材免疫組織化學(xué)染色;定期取創(chuàng)面組織進(jìn)行HE染色組織學(xué)觀察,冰凍切片進(jìn)行熒光顯微鏡檢測(cè)PKH26陽性細(xì)胞。結(jié)果:實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組裸鼠創(chuàng)傷皮膚均出現(xiàn)愈合,通過大體觀察和計(jì)算創(chuàng)面收縮率結(jié)果發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組的創(chuàng)面愈合快于對(duì)照組;實(shí)驗(yàn)組愈合創(chuàng)面的上皮化較對(duì)照組好,血管生成更豐富;實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組在各時(shí)間段均未在創(chuàng)面區(qū)域組織內(nèi)發(fā)現(xiàn)PKH26陽性的細(xì)胞;抗人單抗免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組創(chuàng)面區(qū)域在3w后各抗體均有表達(dá),提示遷移至裸鼠皮膚創(chuàng)面參與修復(fù)的細(xì)胞可能來源于移植的人CF細(xì)胞。 綜上所述,CF細(xì)胞在體外來源廣泛,體外較易分離培養(yǎng),通過某些細(xì)胞因子的作用可以有效促進(jìn)其增殖。CF細(xì)胞作為一種創(chuàng)傷修復(fù)過程中的重要效應(yīng)細(xì)胞,能有效促進(jìn)FBs的增殖和提高其遷移能力,但其對(duì)KCs細(xì)胞是否在體內(nèi)和體外作用一致還需要進(jìn)一步研究;作為一種AS細(xì)胞,CF細(xì)胞在體外一定條件下可向多個(gè)方向進(jìn)行分化,在干細(xì)胞移植治療應(yīng)用中具有重要研究和應(yīng)用價(jià)值;通過體內(nèi)移植CF細(xì)胞可以有效促進(jìn)皮膚創(chuàng)面的愈合,在急慢性以及大面積皮膚創(chuàng)傷的治療上具有良好應(yīng)用前景
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號(hào)】：R329

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