發(fā)布時(shí)間：2018-02-03 04:11

  本文關(guān)鍵詞： 弓形蟲 易感性 CD4~+ CD25~+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞 免疫抑制 免疫平衡　出處：《南京醫(yī)科大學(xué)》2009年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：剛地弓形蟲(Toxoplasma gondii)是一種細(xì)胞內(nèi)寄生原蟲,也是一種危害嚴(yán)重的人畜共患致病原蟲。人體感染弓形蟲后,大多數(shù)為無癥狀的隱性感染者,只有當(dāng)機(jī)體免疫功能低下或嚴(yán)重感染時(shí),才會出現(xiàn)臨床表現(xiàn)。近年來,隨著器官移植、骨髓移植以及艾滋病患者的增多,弓形蟲病的發(fā)病人數(shù)也在逐漸增多,且弓形蟲病常常造成嚴(yán)重的的病理損害。 作為一種重要的機(jī)會性致病原蟲,弓形蟲的致病作用與蟲株毒力、宿主的免疫狀態(tài)有關(guān)。建立合適的動物模型是深入研究弓形蟲感染宿主的免疫機(jī)制乃至致病機(jī)制的關(guān)鍵所在。根據(jù)蟲株的侵襲力、繁殖速度、包囊形成與否以及對宿主的致死率等,剛地弓形蟲可分為強(qiáng)毒株和弱毒株系。強(qiáng)毒株對常用的任何品系的實(shí)驗(yàn)動物小鼠都極為敏感,小鼠腹腔或皮下接種感染后,速殖子可在小鼠體內(nèi)迅速增殖,若不治療,可引起急性的致死性感染,不能形成包囊進(jìn)入慢性感染階段,因此小鼠常作為弓形蟲急性感染的動物模型。但是人類弓形蟲自然感染多表現(xiàn)為隱性感染,因此建立弓形蟲慢性感染狀態(tài)的動物模型對人類弓形蟲病的研究和防治更具有實(shí)際意義。因此,我們在研究中用的是弱毒株系弓形蟲Prugniaud株。但是迄今為止國內(nèi)外對Prugniaud株感染小鼠建模的有關(guān)情況卻報(bào)道很少。 弓形蟲感染宿主后的后果取決于宿主和蟲體之間的相互作用。蟲體方面主要和蟲株的類型和傳代次數(shù)有關(guān)。宿主方面,一直被認(rèn)為是機(jī)體抵抗弓形蟲感染的細(xì)胞免疫是人體主要的抗弓形蟲感染的保護(hù)性免疫,它在抑制蟲體繁殖、防止包囊活化、清除蟲體、控制蟲血癥等方面起重要作用。與弓形蟲感染免疫相關(guān)的細(xì)胞因子包括免疫上調(diào)因子和免疫下調(diào)因子。免疫上調(diào)因子(IFN-γ、IL-2、TNF-α等)主要由Th1細(xì)胞及MФ產(chǎn)生;免疫下調(diào)因子(IL-4、IL-6、IL-10等)則主要由Th2細(xì)胞產(chǎn)生。在弓形蟲不同感染時(shí)期,免疫上調(diào)因子和免疫下調(diào)因子的表達(dá)水平及出現(xiàn)時(shí)間有所不同。另外同某些病原體一樣,弓形蟲在感染過程中會誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生短暫的免疫抑制,這種免疫抑制被認(rèn)為是弓形蟲的一種逃避宿主防御系統(tǒng)攻擊的保護(hù)性機(jī)制。 近年來,隨著一群具有抑制功能的CD4~+ CD25~+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)和被深入研究,越來越多的證據(jù)表明此群細(xì)胞在調(diào)節(jié)病原體感染免疫中起重要作用。研究發(fā)現(xiàn)它們可在一定程度上通過限制對感染部位的免疫應(yīng)答的敏感性來抑制過度的免疫應(yīng)答,從而導(dǎo)致病原體的長期存在。在碩大利什曼原蟲感染中,CD4~+ CD25~+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞可通過抑制易感鼠Th2應(yīng)答或是抗性鼠的Th1應(yīng)答使機(jī)體避免產(chǎn)生過強(qiáng)的免疫反應(yīng),也可使寄生蟲易于存活。 基于國內(nèi)外對弓形蟲Prugniaud株的研究現(xiàn)狀和弓形蟲感染后的免疫特征。本研究擬從三方面進(jìn)行探索:第一:探討建立弓形蟲Prugniaud株慢性感染小鼠模型的條件;第二:初步探討引起對該株易感小鼠急性感染死亡的免疫學(xué)因素;第三:利用建立的慢性感染小鼠模型,研究CD4~+CD25~+ T細(xì)胞在弓形蟲慢性感染小鼠免疫抑制和免疫平衡方面的作用,從新的角度探討慢性感染弓形蟲后保護(hù)性免疫機(jī)制。 目的: 建立弓形蟲Prugniaud株慢性感染小鼠模型,初步探討對此株易感小鼠急性感染死亡的免疫學(xué)因素,研究弓形蟲慢性感染后的相關(guān)免疫學(xué)保護(hù)機(jī)制。 方法: 1、參考文獻(xiàn)純化弓形蟲包囊的方法并加以改良,用淋巴細(xì)胞分離液高速離心法純化包囊,并通過鏡檢和接種小鼠來鑒定包囊的純度和活性。 2、采用腹腔注射包囊的感染方式,用不同的感染劑量感染C57BL/6、BALB/c和ICR三種品系小鼠(C57BL/6、BALB/c均分5個(gè)包囊/只小鼠組和10個(gè)包囊/只小鼠組2組,ICR分5個(gè)包囊/只小鼠,10個(gè)包囊/只小鼠和20個(gè)包囊/只小鼠3組)對比不同品系小鼠對弓形蟲Prugniaud株的易感性,觀察小鼠感染后狀態(tài)、生存期和病理特征。 3、在生存期內(nèi)(包括小鼠急性發(fā)病瀕死期)檢測3種小鼠(C57BL/6、BALB/c和ICR小鼠)脾臟單個(gè)核細(xì)胞中Th1與Th2細(xì)胞的比例動態(tài)變化。同期小鼠肝、肺、腦組織提取DNA做弓形蟲特異引物PCR擴(kuò)增驗(yàn)證小鼠感染成功。 4、利用建立的弓形蟲Prugniaud株慢性感染ICR小鼠模型,檢測感染前和感染后1w、2w、3w、5w脾臟單個(gè)核細(xì)胞中Th1型、Th2型和CD4~+ CD25~+調(diào)節(jié)T細(xì)胞占CD4~+ T細(xì)胞的比例;同期小鼠腦組織一半用于勻漿包囊觀察,一半用于制備小鼠腦組織病理切片。 結(jié)果: 1、參考文獻(xiàn)方法并加以改良后,純化出的包囊鏡下觀察純度較高,接種易感品系小鼠可致小鼠短期內(nèi)發(fā)病死亡。 2、采用腹腔注射10個(gè)包囊/只小鼠或5個(gè)包囊/只小鼠感染BALB/c和C57BL/6小鼠均可使兩種小鼠在感染后8 d左右發(fā)病并且90 %左右小鼠發(fā)生急性感染死亡,而ICR小鼠感染5個(gè)包囊/只小鼠、10個(gè)包囊/小鼠或20個(gè)包囊/只小鼠時(shí)均可較穩(wěn)定地度過急性感染期,只有約10 %左右小鼠發(fā)生死亡。 3、三種小鼠在接近發(fā)病瀕死期均具有較高比例的Th1型細(xì)胞。 4、在整個(gè)實(shí)驗(yàn)期中,免疫抑制期(Th1下調(diào)期)是CD4~+ CD25~+調(diào)節(jié)T細(xì)胞的比例最高峰。在小鼠癥狀明顯的急性感染期,小鼠腦組織并沒有很嚴(yán)重的病理損傷。 結(jié)論: 1、通過對文獻(xiàn)方法進(jìn)行改良后的弓形蟲包囊純化法,可以成功分離小鼠腦組織勻漿弓形蟲包囊。 2、在ICR小鼠通過腹腔注射包囊方式可以穩(wěn)定建立弓形蟲慢性感染小鼠模型,一般選擇10個(gè)包囊/只小鼠、腹腔注射的方式進(jìn)行感染。 3、易感品系小鼠易感致死的原因可能系Th1與Th2免疫反應(yīng)不平衡所致,過強(qiáng)的Th1型免疫應(yīng)答可能是導(dǎo)致小鼠急性感染發(fā)生死亡的主要因素之一。 4、CD4~+ CD25~+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞參與了弓形蟲感染后小鼠的免疫抑制和免疫平衡。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號】：R392

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：1486378