本文關(guān)鍵詞： 真皮 間充質(zhì)干細(xì)胞 硬皮病 厚度 結(jié)締組織生長(zhǎng)因子　出處：《河北醫(yī)科大學(xué)》2014年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：目的：硬皮病（scleroderma，SD）是以彌漫性或局限性的皮膚和內(nèi)臟器官纖維化、硬化性為特征的結(jié)締組織病，其發(fā)病率占到結(jié)締組織疾病中的第三位，并呈逐年增加的趨勢(shì)。硬皮病發(fā)病隱匿且機(jī)制復(fù)雜未明，難以診斷和治療，長(zhǎng)期以來(lái)成活率低。目前國(guó)內(nèi)外的治療主要是針對(duì)免疫系統(tǒng)、血管系統(tǒng)及膠原纖維合成的改變與異常，但治療效果并不理想。因此，尋求更為安全、有效的治理方法就成為當(dāng)務(wù)之急。近年來(lái)，隨著人們對(duì)干細(xì)胞研究的進(jìn)一步發(fā)展，其在治療其他疾病方面取得明顯成效。間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells,MSCs)來(lái)源豐富，并且具有自我更新及多向分化的能力，同時(shí)還具有低免疫原性的特點(diǎn)。真皮間充質(zhì)干細(xì)胞(dermalmesenchymal stem cells,DMSCs），易于提取，并具有干細(xì)胞的一般特性，使其成為治療硬皮病的一個(gè)新選擇。結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(connective tissuegrowth factor,CTGF）在硬皮病的發(fā)生和發(fā)展中起到致纖維化和維持纖維化的作用。本研究通過(guò)建立具有局部皮膚損害的硬皮病小鼠模型，通過(guò)皮下注射小鼠真皮間充質(zhì)干細(xì)胞(mouse dermis-derived mesenchymal stemcells,mdMSCs)來(lái)觀察其對(duì)局部皮損的改變和結(jié)締組織生長(zhǎng)因子含量的影響，為探討臨床應(yīng)用真皮間充質(zhì)干細(xì)胞治療硬皮病提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法： 1以組織消化法分離、純化mdMSCs，并進(jìn)行常規(guī)傳代培養(yǎng)。 2觀察第3代mdMSCs的形態(tài)，使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞的生長(zhǎng)周期和表面標(biāo)記。 3使用PKH26進(jìn)行mdMSCs標(biāo)記。 4硬皮病小鼠模型的制備：將24只6周齡雌性BALB/C小鼠隨機(jī)分為A組(11只)、B組(11只)、C組（2只）。A、B組連續(xù)背部皮下注射500μg/ml的博來(lái)霉素，每日1次，每次0.1ml，C組注射PBS，共3周，用頸椎脫臼法隨機(jī)處死A、B組中的2只造模小鼠和C組小鼠，取小鼠背部注射區(qū)皮膚組織行HE染色、苦味酸-酸性品紅染色和CTGF免疫組織化學(xué)染色，證實(shí)造模成功。 5向A組硬皮病小鼠模型局部皮損處皮下注射已標(biāo)記的mdMSCs，B組注射PBS，讓小鼠自由獲取食水，觀察并記錄小鼠注射區(qū)皮膚彈性、外觀等大體變化。 6三周后將A、B組小鼠全部頸椎脫臼法處死，，切取背部注射區(qū)皮膚，制作組織病理切片，測(cè)定各小鼠真皮的厚度及皮內(nèi)CTGF的含量。熒光顯微鏡下觀察熒光陽(yáng)性的細(xì)胞在小鼠局部皮損內(nèi)的分布。 7運(yùn)用SPSS統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。 結(jié)果： 1以組織消化分離、純化得到的細(xì)胞，可傳代逐步得到呈多角形、扯布狀形態(tài)的細(xì)胞。 2流式細(xì)胞儀檢測(cè)mdMSCs細(xì)胞周期，通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的DNA含量發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)細(xì)胞處于靜止期(G1期：83.02%)，只有少數(shù)處于分裂期(S/G2期：16.98%，G1/G2期：1.95%)，表面標(biāo)記顯示CD29+、CD44+，雙陽(yáng)性細(xì)胞約為90%，結(jié)合觀察所得細(xì)胞的形態(tài)證實(shí)分離純化培養(yǎng)的細(xì)胞為mdMSCs。 3熒光顯微鏡下觀察PKH26標(biāo)記后的mdMSCs，可見(jiàn)細(xì)胞胞膜呈均勻的紅色熒光，且子代也帶有熒光，PKH26標(biāo)記不影響細(xì)胞活性及增殖能力。 4A、B組小鼠在連續(xù)3周皮下注射博來(lái)霉素成功誘導(dǎo)出具有局部皮膚損害的硬皮病小鼠模型，并且均未死亡及未見(jiàn)明顯全身不良反應(yīng)。 5A組小鼠經(jīng)真皮間充質(zhì)干細(xì)胞局部皮損處皮下1哦，注射3周后，熒光顯微鏡下觀察可見(jiàn)已標(biāo)記的干細(xì)胞分布于真皮層和皮下組織，小鼠皮膚真皮的厚度較B組小鼠皮膚真皮的厚度明顯變�。≒值為0.0240.05），CTGF含量在兩組間無(wú)明顯差異(P值為0.1760.05)。 結(jié)論： 1BLM500μg/ml皮下注射SPF級(jí)BALB/C小鼠，每日1次，每次0.1ml，連續(xù)3周可成功建立具有局部皮膚損害的硬皮病小鼠模型。 2mdMSCs局部皮損處皮下注射可有效改善硬皮病小鼠模型局部皮損的硬化情況和真皮厚度。 3mdMSCs局部皮損處皮下注射對(duì)硬皮病小鼠模型局部皮損的影響可能并不是單一通過(guò)調(diào)控CTGF的表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。
[Abstract]:Objective: scleroderma (scleroderma, SD) is a diffuse or localized skin and visceral organ fibrosis, sclerosis of connective tissue disease characterized by the incidence of a disease to connective tissue disease in third, and showed a rising trend. The incidence of occult and scleroderma complicated mechanism is unknown, it is difficult to diagnosis and treatment. Long term survival rate is low. The current treatment at home and abroad is mainly aimed at the change of the immune system, vascular system and collagen synthesis and abnormal, but the treatment effect is not ideal. Therefore, looking for a safe and effective treatment method has become a pressing matter of the moment. In recent years, with the further development of stem cell research, the obvious effect in the treatment of other diseases. Mesenchymal stem cells (mesenchymal stem cells, MSCs) rich source, and has the ability of self-renewal and multi-directional differentiation, with low immunogenicity The characteristics of dermal mesenchymal stem cells (dermalmesenchymal stem cells, DMSCs), easy to extract, and has general characteristics of stem cells, make it become a new choice for the treatment of scleroderma. Connective tissue growth factor (connective tissuegrowth, factor, CTGF) plays a role in fibrosis and fibrosis in the occurrence and development of maintenance scleroderma disease. Scleroderma mouse model with local skin damage in this paper, by subcutaneous injection of mouse dermis derived mesenchymal stem cells (mouse dermis-derived mesenchymal stemcells, mdMSCs) to observe the influence of the changes of local skin and connective tissue growth factor in the clinical application of dermal mesenchymal stem cells to provide experimental basis for the treatment of scleroderma.
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本文編號(hào)：1480597