本文關(guān)鍵詞： 缺血預(yù)適應(yīng) 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞 基因芯片 siRNA HIF-1α　出處：《南方醫(yī)科大學(xué)》2009年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：冠心病心肌梗死的發(fā)病率越來(lái)越多,經(jīng)皮冠脈介入(PCI)和溶栓治療使冠脈血管盡早再通以達(dá)到防治心肌梗死范圍進(jìn)一步擴(kuò)大,已經(jīng)成為臨床廣泛應(yīng)用的治療手段;但恢復(fù)缺血心肌組織的血流灌注本身可以加重心肌的進(jìn)一步損傷,即缺血/再灌注損傷。而目前對(duì)于缺血、缺血/再灌注損傷的心肌保護(hù),仍缺乏確實(shí)可行而又直接的臨床治療手段。日益增多的研究發(fā)現(xiàn),缺血預(yù)適應(yīng)是機(jī)體產(chǎn)生的一種強(qiáng)大的內(nèi)源性心肌缺血、缺血/再灌注損傷的自我保護(hù)機(jī)制,最早發(fā)現(xiàn)于心肌的缺血預(yù)適應(yīng)是指短暫缺血/再灌注后能使組織細(xì)胞耐受隨后長(zhǎng)時(shí)間缺血損傷的現(xiàn)象。這一自我保護(hù)機(jī)制也發(fā)現(xiàn)存在于血管內(nèi)皮細(xì)胞。 血管內(nèi)皮細(xì)胞位于血液和組織器官的關(guān)鍵界面,不僅是血液和組織之間的重要屏障,可以防治有害因素對(duì)內(nèi)皮下實(shí)體組織細(xì)胞的侵襲,也是極其活躍的分泌組織,可以分泌多種生物活性物質(zhì)以調(diào)節(jié)對(duì)組織的氧和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)供應(yīng),從而維持組織器官的正常功能。早期的研究證明,在缺血、缺血/再灌注損傷過(guò)程中,血管內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的損害可以引起心肌細(xì)胞等實(shí)質(zhì)細(xì)胞的損傷發(fā)生;血管內(nèi)皮細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能異常早于心肌細(xì)胞的損傷,缺血缺氧導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞凋亡先于心肌細(xì)胞凋亡的發(fā)生,而內(nèi)皮細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能的恢復(fù)快于實(shí)質(zhì)細(xì)胞。提示保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞的健康完整有可能預(yù)防或減輕心肌細(xì)胞的缺血、缺血/再灌注損傷。因而,研究血管內(nèi)皮細(xì)胞缺血、缺血/再灌注損傷的預(yù)適應(yīng)保護(hù),對(duì)保護(hù)心肌細(xì)胞的缺血損傷具有重要理論和臨床意義。 迄今為止,缺血預(yù)適應(yīng)的機(jī)制仍未完全清楚。首先,缺血預(yù)適應(yīng)涉及到十分復(fù)雜的作用機(jī)制。針對(duì)一個(gè)或數(shù)個(gè)基因的研究多有報(bào)道,但缺血預(yù)適應(yīng)保護(hù)是機(jī)體對(duì)缺血、缺血/再灌注損傷的一種系統(tǒng)性保護(hù)反應(yīng),涉及到預(yù)適應(yīng)這一系統(tǒng)中所有反應(yīng)基因,這些反應(yīng)基因的組合,最終共同決定了預(yù)適應(yīng)保護(hù)效應(yīng)。其次,缺氧誘導(dǎo)因子—1a(hypoxia inducible factor-1a,HIF-1a)基因是介導(dǎo)缺氧反應(yīng)基因轉(zhuǎn)錄活性的關(guān)鍵通道,在缺氧調(diào)節(jié)反應(yīng)中起關(guān)鍵作用,通過(guò)增加HIF-1a基因表達(dá),觀察到對(duì)缺血、缺血/再灌注損傷的組織細(xì)胞具有保護(hù)作用。但沉默HIF-1a基因表達(dá),從反面觀察以證實(shí)HIF-1a基因在預(yù)適應(yīng)保護(hù)中的作用尚鮮有報(bào)道。從這些思考出發(fā),我們的研究擬對(duì)預(yù)適應(yīng)保護(hù)的整體基因反應(yīng)作一系統(tǒng)性觀察,并沉默HIF-1a基因表達(dá)后,評(píng)估預(yù)適應(yīng)保護(hù)效應(yīng),以作為預(yù)適應(yīng)及其機(jī)制研究中的一個(gè)有益補(bǔ)充和完善。 目的: 通過(guò)建立體外人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(Human umbilical vein endothelial cells.HUVECs)缺氧預(yù)適應(yīng)模型,模仿體內(nèi)缺血預(yù)適應(yīng)保護(hù),系統(tǒng)檢測(cè)缺氧預(yù)適應(yīng)保護(hù)效應(yīng)的基因表達(dá)改變,并進(jìn)而研究HIF-1a基因在HUVECs缺氧預(yù)適應(yīng)、缺氧/再氧化損傷中的作用,探討缺氧預(yù)適應(yīng)介導(dǎo)的HUVECs保護(hù)作用機(jī)理,為缺氧預(yù)適應(yīng)保護(hù)的潛在臨床應(yīng)用打下基礎(chǔ)并提供理論依據(jù)。 方法: 1、HUVECs培養(yǎng)并鑒定:經(jīng)內(nèi)皮細(xì)胞特異的Ⅷ因子相關(guān)抗原的單克隆抗體免疫熒光染色鑒定內(nèi)皮細(xì)胞。 2、缺氧預(yù)適應(yīng)、缺氧/再氧化損傷模型建立:缺氧預(yù)適應(yīng)由不同循環(huán)的預(yù)缺氧1h+再氧化1h組成,而缺氧/再氧化損傷由較長(zhǎng)缺氧6h+再氧化1h組成。使用不同預(yù)缺氧/再氧化循環(huán)模擬體內(nèi)缺血預(yù)適應(yīng),經(jīng)檢測(cè)MTT活性及LDH水平,以發(fā)現(xiàn)對(duì)缺氧/再氧化損傷保護(hù)的最適模型。 3、缺氧預(yù)適應(yīng)后HUVECs總RNA、蛋白樣品的抽提:使用TRIzol試劑盒對(duì)預(yù)適應(yīng)后的HUVECs總RNA以及蛋白質(zhì)進(jìn)行抽提、純化、定量,并電泳及紫外分光光度法對(duì)質(zhì)量進(jìn)行鑒定,質(zhì)量符合要求的樣本用于進(jìn)一步的研究。 4、基因芯片檢測(cè)缺氧預(yù)適應(yīng)保護(hù)的基因表達(dá):ArrayReady Oligo Set V2.0芯片(含人類21329個(gè)基因)對(duì)缺氧預(yù)適應(yīng)保護(hù)進(jìn)行基因表達(dá)檢測(cè),通過(guò)GenePixPro 5.1、Genesifter、Gene ontology等對(duì)基因芯片結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。熒光實(shí)時(shí)定量PCR對(duì)芯片結(jié)果進(jìn)行可靠性驗(yàn)證。 5、HIF-1a基因siRNA的準(zhǔn)備:核苷酸序列為AAGGGTAAAGAACAAAACACA的HIF-1a基因特異性siRNA合成于Ambion公司,首先對(duì)其進(jìn)行轉(zhuǎn)染條件優(yōu)化,發(fā)現(xiàn)最適轉(zhuǎn)染濃度及基因沉默效應(yīng)。 6、用最適濃度siRNA轉(zhuǎn)染經(jīng)過(guò)或未經(jīng)過(guò)缺氧預(yù)適應(yīng)處理的HUVECs,通過(guò)毛細(xì)管實(shí)時(shí)熒光定量PCR、western blot方法檢測(cè)HIF-1a表達(dá)沉默,通過(guò)LDH、Caspase-3測(cè)定以及Annexin V-Cy3標(biāo)記免疫熒光凋亡檢測(cè),評(píng)價(jià)預(yù)適應(yīng)保護(hù)效應(yīng)及與HIF-1a基因的關(guān)系。 7、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:結(jié)果以均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)表示,采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 17.0進(jìn)行One-Way ANOVA統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。首先進(jìn)行Levene方差齊性檢驗(yàn);對(duì)于方差齊性的進(jìn)行方差分析及相應(yīng)的LSD多重比較法分析;對(duì)于方差不齊的使用近似F檢驗(yàn)Welch法及其相應(yīng)的Dunnett's 3多重比較方法分析;對(duì)于兩獨(dú)立樣本均數(shù)比較采用兩樣本t檢驗(yàn)分析。以α=0.05作為顯著性的判斷標(biāo)準(zhǔn)。 結(jié)果: 1、通過(guò)對(duì)培養(yǎng)基氧濃度的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè),對(duì)不同預(yù)缺氧/再氧化循環(huán)的篩選,發(fā)現(xiàn)經(jīng)1～3次循環(huán)的缺氧預(yù)適應(yīng)均具有保護(hù)HUVECs缺氧/再氧化損傷作用,但單次循環(huán)的預(yù)缺氧+再氧化作為預(yù)適應(yīng)刺激,較多次循環(huán)的缺氧預(yù)適應(yīng)有更好的保護(hù)作用。 2、經(jīng)基因芯片檢測(cè)發(fā)現(xiàn),預(yù)缺氧后的5個(gè)時(shí)間點(diǎn)共有不同的809個(gè)差異性表達(dá)基因,其表達(dá)改變(包括上調(diào)、下調(diào))均超過(guò)常氧對(duì)照組2倍,且經(jīng)ANOVA檢測(cè)其P＜0.05。分組分析發(fā)現(xiàn),預(yù)缺氧1小時(shí)(H1h組,即相當(dāng)于預(yù)缺氧后再氧化0h)有460個(gè)差異表達(dá)基因,其中上調(diào)基因192個(gè),下調(diào)基因268個(gè);缺氧預(yù)適應(yīng)后2小時(shí)(HPC2h組,即相當(dāng)于預(yù)缺氧后再氧化3h)有406個(gè),其中244個(gè)基因表達(dá)下調(diào),上調(diào)基因162個(gè);預(yù)適應(yīng)后5小時(shí)(HPC5h組,即相當(dāng)于預(yù)缺氧后再氧化6h)有322個(gè)基因,其中下調(diào)基因223個(gè),上調(diào)基因98個(gè);預(yù)適應(yīng)后12小時(shí)(HPC12h組,即相當(dāng)于預(yù)缺氧后再氧化13h)有350個(gè)基因,其中下調(diào)基因266個(gè),上調(diào)基因84個(gè);預(yù)適應(yīng)后24小時(shí)(HPC24h組,即相當(dāng)于預(yù)缺氧后再氧化25h)有183個(gè)基因,其中下調(diào)基因132個(gè),上調(diào)基因51。在H1h、HPC2h、HPC5h、HPC12h、HPC24h點(diǎn)新增的差異表達(dá)數(shù)目分別為460、191、53、48、88個(gè)。綜合分析,下調(diào)基因較上調(diào)的多。 3、基因芯片結(jié)果的亞分析發(fā)現(xiàn),下調(diào)或上調(diào)的差異表達(dá)基因或新增差異表達(dá)基因改變表現(xiàn)出三段式的改變,分別相對(duì)應(yīng)于早期預(yù)適應(yīng)保護(hù)期、中間無(wú)保護(hù)期及延遲預(yù)適應(yīng)保護(hù)期,提示一種缺氧預(yù)適應(yīng)保護(hù)的基因數(shù)改變與預(yù)適應(yīng)保護(hù)的一致性變化。缺氧預(yù)適應(yīng)誘導(dǎo)的差異表達(dá)基因除了12個(gè)基因從H1h點(diǎn)持續(xù)到HPC24h點(diǎn)外,大多數(shù)基因的差異表達(dá)持續(xù)時(shí)間較短。809個(gè)差異表達(dá)基因分屬22種不同功能類別。表明缺氧預(yù)適應(yīng)是多基因、多功能系統(tǒng)共同參與的復(fù)雜的生物調(diào)節(jié)過(guò)程。 4、對(duì)差異表達(dá)基因中的7個(gè)基因進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR測(cè)定,其結(jié)果與芯片檢測(cè)結(jié)果的表達(dá)趨勢(shì)高度相似,表明芯片檢測(cè)結(jié)果的可靠性。 5、初步分析發(fā)現(xiàn)12差異表達(dá)基因?yàn)橐郧耙呀?jīng)證實(shí)的與缺氧預(yù)適應(yīng)保護(hù)有關(guān)基因,包括損害性基因受抑制而下調(diào),保護(hù)性基因受激活而上調(diào)。提示HUVECs缺氧預(yù)適應(yīng)效應(yīng)是保護(hù)性基因與損害性基因的動(dòng)態(tài)平衡過(guò)程。且HUVECs缺氧預(yù)適應(yīng)保護(hù)中存在著數(shù)量眾多的全新差異表達(dá)基因,其在HPC中作用有待進(jìn)一步深入研究。 5、siRNA沉默HIF-1a基因表達(dá)后,缺氧/再氧化損傷導(dǎo)致HUVECs釋放更多的LDH,表明血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷加重,而Caspase-3的水平改變不顯著,表明并不加重其凋亡。 6、siRNA沉默HIF-1a基因表達(dá)后,缺氧預(yù)適應(yīng)對(duì)HUVECs的缺氧/再氧化損傷仍有保護(hù)作用,但這種保護(hù)作用是不完全的、明顯減弱的。從一個(gè)方面提示HUVECs的缺氧預(yù)適應(yīng)保護(hù)與HIF-1a基因的表達(dá)具有明顯聯(lián)系。 結(jié)論: 1、成功建立了缺血預(yù)適應(yīng)的HUVECs模型。 2、缺氧/再氧化損傷對(duì)HUVECs具有顯著的損害作用,而缺氧預(yù)適應(yīng)可以顯著減輕缺氧/再氧化損傷對(duì)HUVECs的損害作用。 3、參與調(diào)節(jié)缺氧預(yù)適應(yīng)HUVECs保護(hù)的基因多達(dá)809個(gè),參與的功能系統(tǒng)多達(dá)23個(gè)。提示缺氧預(yù)適應(yīng)是多基因、多功能系統(tǒng)共同參與的復(fù)雜的生物調(diào)節(jié)過(guò)程。 4、已知的12個(gè)預(yù)適應(yīng)保護(hù)有關(guān)基因表現(xiàn)為損害性基因受抑制而下調(diào),保護(hù)性基因受激活而上調(diào)。提示HUVECs缺氧預(yù)適應(yīng)效應(yīng)是保護(hù)性基因與損害性基因的動(dòng)態(tài)平衡過(guò)程。且HUVECs缺氧預(yù)適應(yīng)保護(hù)中存在著數(shù)量眾多的全新差異表達(dá)基因,其在HPC中作用有待進(jìn)一步深入研究。 5、HIF-1a基因抑制后,加重缺氧/再氧化損傷對(duì)HUVECs的損害作用,但并不加重其對(duì)HUVECs的誘導(dǎo)凋亡作用。 6、HIF-1a基因參與缺氧預(yù)適應(yīng)對(duì)HUVECs的保護(hù)效應(yīng),是缺氧預(yù)適應(yīng)保護(hù)調(diào)節(jié)的重要因素。 7、HUVECs的缺氧/再氧化損傷與HIF-1a基因的表達(dá)調(diào)節(jié)具有明顯聯(lián)系。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號(hào)】：R363

【參考文獻(xiàn)】

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1 楊杰;宗長(zhǎng)宏;王唯析;胡曉丹;李明;陳國(guó)敏;;血管活性腸肽抑制大鼠腦缺血誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和iNOS表達(dá)[J];四川大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2008年04期

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本文編號(hào)：1477713