本文關鍵詞： 呼吸道合胞病毒 表位預測 F蛋白 G蛋白 中和表位　出處：《西北農林科技大學》2009年碩士論文　論文類型：學位論文

【摘要】： 呼吸道合胞病毒( Respiratory syncytial virus,RSV)是引起嬰幼兒和易感成人呼吸道感染最主要的病毒性病原。它除了引起上呼吸道感染外,還是引起毛細支氣管肺炎等下呼吸道感染的重要原因。自然感染率極高,對嬰幼兒、老年人及免疫抑制患者能引起嚴重的下呼吸道炎癥反應。世界衛(wèi)生組織(WHO)十分重視該疫苗的開發(fā),呼吁開發(fā)安全有效的RSV疫苗。但由于多種限制因素,例如:RSV A、B兩亞型交錯出現、選擇合適的載體蛋白較困難等問題,迄今尚無成功的疫苗問世。 為尋求可以用于RSV疫苗研制的表位,在病毒吸附蛋白(G蛋白)和融合蛋白(F蛋白)中尋找合適的中和表位,以Balb/c小鼠為動物模型,通過動物試驗檢測中和表位的效果。 通過對吸附蛋白和融合蛋白的生物信息學預測和文獻調研查找,從G蛋白中篩選出五個比較集中的表位,其位于G142-204中,最終選擇了G142-204(命名為G)這段區(qū)間作為研究對象。從F蛋白篩選出兩個表位F205-223和F255-278,使用剛性linker(GPG)來連接,最終選擇F205-223-GPG-F255-278(命名為F)作為研究對象。采用重疊PCR技術,構建了編碼G142-204和Balb/c小鼠血清白蛋白結構域Ⅰ的融合基因(命名為G-M)、F205-223-GPG-F255-278和Balb/c小鼠血清白蛋白結構域Ⅰ的融合基因(命名為F-M)。將融合基因成功構建在原核表達載體pET28a(+)上,并在大腸埃希菌BL21(DE3)表達。經檢測目的蛋白是以包涵體形式表達,采用尿素變性,親和層析法純化,獲得高純度的融合蛋白,純度達到90%。融合蛋白免疫9周齡的雌性Balb/c小鼠,采集小鼠血液,通過ELISA法檢測血清中特異性抗體的抗體亞型,F-M蛋白免疫組IgG1/IgG2a比值為1.47,相比之下,較G-M更趨向于Th1/Th2之間的平衡。免疫融合蛋白后Balb/c小鼠肺部及血清中均能產生抗RSV抗體。免疫小鼠RSV攻毒試驗,F-M免疫組與G-M免疫組都能夠起到保護肺部、降低肺部病毒滴度的作用。本試驗制備的融合蛋白具有一定的病毒中和能力,經過進一步的試驗印證后,有望開發(fā)出一種更加安全有效的RSV疫苗。
[Abstract]:Respiratory syncytial virus (Respiratory syncytial, virus, RSV) is caused by susceptible infants and adult respiratory tract infection is the main pathogenic viruses. In addition it cause upper respiratory tract infection, or cause capillary bronchial pneumonia and other lower respiratory tract infections. The natural infection rate is very high, for infants and young children, the elderly and immunosuppressed patients the lower respiratory tract caused by severe inflammatory reaction. The WHO (WHO) attaches great importance to the development of the vaccine, called for the development of safe and effective RSV vaccine. But due to the limitation of various factors, such as: RSV A, B two subtypes staggered, the appropriate carrier protein is difficult, so far there is no successful advent of vaccines.
In order to find epitope suitable for the development of RSV vaccine, find suitable neutralizing epitope in virus adsorbed protein (G protein) and fusion protein (F protein), and Balb/c mice as animal model, and detect the effect of neutralization epitope by animal test.
The adsorption of protein and fusion protein bioinformatics prediction and literature search, from the G protein were screened five more concentrated epitopes, which is located in G142-204, finally chose G142-204 (named G) of this section as the research object. From the F protein and selected two epitopes of F205-223 and F255-278 linker (GPG), the use of rigid connection, the final choice of F205-223-GPG-F255-278 (named F) as the research object. By using the overlapping PCR technology, constructed the recombinant encoding G142-204 and Balb/c mice serum albumin domain I gene (named G-M), serum albumin fusion domain I F205-223-GPG-F255-278 and Balb/c mouse gene (named F-M). The fusion gene was successfully constructed in prokaryotic expression vector pET28a (+), and in Escherichia coli BL21 (DE3). The expression of the target proteins were expressed in the form of inclusion bodies, using urea denaturation, affinity Chromatography, high purity fusion protein was obtained, the purity of 90%. protein in 9 week old female Balb/c mice were collected by blood, specific antibodies in serum were measured by ELISA antibody subtype, F-M protein IgG1/IgG2a ratio was 1.47, compared with G-M tend to Th1/Th2 balance. The immune fusion protein in lungs and serum of Balb/c mice can produce anti RSV antibody in immunized mice. RSV challenge test, F-M group and G-M group are immune immunity can protect the lungs and reduce the virus titer of lung function. The experimental preparation of fusion protein had the virus neutralizing ability, after further tests confirmed later, is expected to develop a more safe and effective RSV vaccine.

【學位授予單位】：西北農林科技大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2009
【分類號】：R392

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本文編號：1476046