本文關(guān)鍵詞： 丙型肝炎病毒 非結(jié)構(gòu)區(qū)5B蛋白 RNA依賴的RNA聚合酶 基因克隆 蛋白表達(dá)、純化 磁性納米顆粒 活性測(cè)定　出處：《南京醫(yī)科大學(xué)》2008年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】： 全球有3%的人感染丙型肝炎病毒(HCV),可導(dǎo)致肝硬化和肝癌等慢性肝病。目前,無(wú)HCV疫苗,主要用α-干擾素和利巴韋林治療,但有較大的副反應(yīng),并且應(yīng)答率僅約50%。因此,需要研制出更有效更廣譜的抑制劑。HCV NS5B是RNA依賴的RNA聚合酶(RdRp),是HCV復(fù)制的關(guān)鍵酶,在正常的宿主細(xì)胞中不存在這個(gè)酶的相似結(jié)構(gòu)同系物。因此這是一個(gè)抗病毒研究的很好的靶標(biāo),已用于體外篩選HCV抑制劑。體外篩選HCV NS5B蛋白酶抑制劑的關(guān)鍵是獲得溶解性好、活性高的NS5B蛋白,NS5B蛋白C端對(duì)其酶活性及水溶性有影響。本研究制備NS5B蛋白C端刪除不同長(zhǎng)度的三種重組蛋白,以篩選溶解性好、活性高的NS5B蛋白,建立體外檢測(cè)NS5B蛋白R(shí)NA依賴的RNA聚合酶活性的新方法,為高通量篩選HCV抑制劑奠定基礎(chǔ)。 構(gòu)建了高效表達(dá)全長(zhǎng)NS5B(NS5B-FL)、C端截短21個(gè)氨基酸NS5B(NS5B-C21)及C端截短51個(gè)氨基酸NS5B(NS5B-C51)蛋白的三種工程菌。利用PCR技術(shù)擴(kuò)增三種長(zhǎng)度的NS5B基因,BamHⅠ和XhoⅠ雙酶酶切后連接到經(jīng)同樣酶酶切的原核表達(dá)載體pET-28a(+)上,轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)菌株,IPTG誘導(dǎo)表達(dá),SDS-PAGE電泳進(jìn)行鑒定。成功構(gòu)建了三種重組質(zhì)粒pET-28a(+)-NS5B-FL,pET-28a(+)-NS5B-C21,pET-28a(+)-NS5B-C51,分別表達(dá)6His-NS5B-FL,6His-NS5B-C21,6His-NS5B-C51三種融合蛋白,表達(dá)的6His-NS5B-FL主要以包涵體形式存在,而表達(dá)的6His-NS5B-C21、6His-NS5B-C51的可溶性明顯增加。 建立了表達(dá)的三種HCV NS5B蛋白的純化方法,純化獲得了三種蛋白。為易于純化,在表達(dá)三種蛋白的C端均增加了6xHis標(biāo)簽,用Ni柱親和層析純化,獲得的三種蛋白經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè),均顯示單一的蛋白條帶。純化的NS5B-C21蛋白濃度相對(duì)較高,選用此蛋白用于NS5B RNA聚合酶活性分析。對(duì)獲得的三種蛋白的抗原性進(jìn)行了分析,間接ELISA法檢測(cè)已知的HCV抗體陽(yáng)性及陰性血清,顯示三種蛋白均有較好的抗原性和特異性,提示該蛋白不僅可用于酶活性分析,也可能用于抗體檢測(cè)及研制檢測(cè)試劑。 將納米磁分離、酶聯(lián)等技術(shù)相結(jié)合,利用表達(dá)的NS5B蛋白,建立了一種體外檢測(cè)NS5B RNA聚合酶活性的新方法。將RNA模板修飾固定在核殼結(jié)構(gòu)復(fù)合磁性納米顆粒上并加入磁分離微孔反應(yīng)管內(nèi),再加入引物,純化的NS5B蛋白酶,NTP,Bio-11-UTP等反應(yīng)體系。通過摻入生物素標(biāo)記單體,利用NS5B蛋白的RNA依賴的RNA聚合酶的活性,使另一條RNA鏈得到延伸,在外磁場(chǎng)下分離除去非特異性吸附片段,再與酶標(biāo)記的親和素結(jié)合,洗滌后,向微孔內(nèi)加入底物顯色劑,通過是否顯色來(lái)判定NS5B蛋白酶活性。該方法可直接通過顯色來(lái)檢測(cè)NS5B的RNA聚合酶活性,并且可以在96孔板內(nèi)進(jìn)行高通量檢測(cè),為高通量篩選NS5B蛋白酶抑制劑奠定了基礎(chǔ)。
[Abstract]:3% people worldwide are infected with hepatitis C virus (HCV), which can lead to chronic liver diseases such as liver cirrhosis and liver cancer. At present, there is no HCV vaccine, mainly treated with interferon 偽 and ribavirin. However, there were larger side effects and the response rate was only about 50%. Therefore, a more effective and broad spectrum inhibitor. HCV NS5B is a RNA dependent RNA polymerase rdRp). It is a key enzyme for HCV replication and does not have a similar structural homologue in normal host cells, so it is a good target for antiviral research. It has been used to screen HCV inhibitors in vitro. The key to screen HCV NS5B protease inhibitors in vitro is to obtain NS5B proteins with good solubility and high activity. The C terminal of NS5B protein had an effect on its enzyme activity and water solubility. In order to screen NS5B protein with good solubility and high activity, three kinds of recombinant proteins of different length were deleted from C terminal of NS5B protein. A new method for in vitro detection of RNA dependent RNA polymerase activity of NS5B protein was established, which laid a foundation for high throughput screening of HCV inhibitors. A novel full-length NS5B-FLR was constructed. C-terminal truncation of 21 amino acids NS5B-C21) and C-terminal truncation of 51 amino acids NS5BN-NS5B-C51). PCR technique was used to amplify three NS5B genes of different lengths. BamH 鈪，

本文編號(hào)：1474191