本文關(guān)鍵詞： 脂多糖 脂多糖結(jié)合蛋白 核糖體展示 噬菌體展示 單鏈Fv抗體文庫 抗體篩選 原核表達 抗原性　出處：《第三軍醫(yī)大學》2009年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：基因工程抗體是在深入了解抗體基因結(jié)構(gòu)和功能的的基礎(chǔ)上,根據(jù)研究者的意圖,利用DNA重組技術(shù),在基因水平設(shè)計生產(chǎn)出新型的抗體,其中單鏈Fv抗體(singe chain variable fragment,scFv)由于分子量小、組織穿透力強,易于構(gòu)建表達等特點是目前研究最為廣泛的基因工程抗體。噬菌體展示或核糖體展示技術(shù)都可以用于高親和力scFv抗體的篩選。噬菌體展示抗體庫是目前發(fā)展最成熟、應用最為廣泛的基因工程抗體篩選技術(shù),通過噬菌體展示技術(shù)使基因工程抗體以融合蛋白的形式展示在噬菌體外殼蛋白gpⅢ或gpⅧ的N端,從而將抗體的基因型和表型連接起來,用固相或液相化抗原與抗體庫孵育,經(jīng)“親和結(jié)合—洗脫—擴增”數(shù)個循環(huán)使特異性克隆得以富集,因而具有簡便、快速和高效的優(yōu)點。核糖體展示抗體庫是一種新型的基因工程抗體體外篩選和分子進化技術(shù),利用體外表達體系以mRNA-核糖體-抗體三元復合物的形式將基因型和表型聯(lián)系起來用于抗體開發(fā)研究。由于所有篩選操作完全在體外進行,庫容量遠大于噬菌體展示文庫,再加上較噬菌體抗體庫技術(shù)更為簡便的建庫和篩選方法、可通過引入突變和重組技術(shù)來提高被篩選蛋白分子的親和力等優(yōu)點使核糖體展示技術(shù)成為一種具有潛力的抗體研發(fā)技術(shù)平臺。 細菌脂多糖(LPS)是內(nèi)毒素的主要組成成分,是嚴重創(chuàng)傷、燒傷及革蘭氏陰性桿菌感染引起的內(nèi)毒素血癥、膿毒癥、感染性休克和多器官功能衰竭綜合征(MODS)等患者死亡的重要原因之一。雖然近年來在臨床治療技術(shù)方面有了較大的進步,但由于其復雜的病理生理過程加大了治療的難度,死亡率一直居高不下。脂多糖結(jié)合蛋白(lipopolysaccharide binding protein,LBP)是一種脂質(zhì)轉(zhuǎn)移分子,能催化磷脂LPS單體與mCD14和sCD14或磷脂的結(jié)合。研究表明,LBP能促進LPS與單核/巨噬細胞膜表面的CD14結(jié)合,形成LPS-LBP-CD14復合物激活單核/巨噬細胞,促進炎癥的發(fā)生、發(fā)展。鑒于LBP能顯著放大LPS的致病作用,研制親和力高、特異性強、穩(wěn)定性好且毒性低的anti-LBP基因工程抗體,以拮抗LBP結(jié)合LPS引起的生物學效應,對內(nèi)毒素血癥的防治將具有重要意義。 本研究以重組人LBP蛋白為抗原,利用核糖體展示和噬菌體展示技術(shù)篩選anti-LBP基因工程抗體,并希望將篩選得到的scFv改造為更穩(wěn)定的小分子抗體(如二硫鍵穩(wěn)定的Fv抗體(disulfied stabilized Fv,dsFv))用于拮抗LBP分子對炎癥反應的放大效應,為內(nèi)毒素致病性機制及防治手段研究的進一步深入提供理論依據(jù)和啟示。 本研究共進行了如下三個方面的工作: 1.收集健康獻血志愿者的白細胞懸液,分離單個核細胞,抽提其總RNA,逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,PCR法構(gòu)建scFv文庫,在此基礎(chǔ)上通過進一步PCR添加5-端T7啟動子、莖環(huán)結(jié)構(gòu)、核糖體結(jié)合位點以及3-端6×His標簽、間隔序列(基因Ⅲ)、莖環(huán)結(jié)構(gòu)等改造成適合核糖體展示的大容量天然人源scFv文庫。本實驗最終共得到純化的PCR產(chǎn)物10.2μg,按1kb大小雙鏈DNA分子每μg的分子數(shù)約為1012計算,本實驗獲得的核糖體展示scFv文庫容量達1013。大容量天然人源核糖體展示scFv文庫的成功構(gòu)建為后續(xù)研究中篩選高親和力抗體及對篩選到的抗體進行改建和進化提供了一種有效的技術(shù)平臺。 2.以人重組LBP蛋白為抗原包被96孔板,利用構(gòu)建好的核糖體展示scFv文庫篩選anti-LBP基因工程抗體,未能得到陽性克隆;改用噬菌體展示scFv文庫共進行了三輪篩選,雖然第三輪篩選共獲得384個陽性克隆,但最終經(jīng)噬菌體ELISA鑒定顯示這些克隆表達的噬菌體抗體對人重組LBP蛋白不具備特異性且親和力不高,說明噬菌體展示技術(shù)也未能篩選得到特異性anti-LBP基因工程抗體。分析兩種抗體庫技術(shù)篩選呈陰性結(jié)果的主要原因是:⑴核糖體展示技術(shù)自身的缺點如在篩選過程中多個核糖體結(jié)合到同一條mRNA模板上引起翻譯不充分、mRNA-核糖體-scFv復合物的不穩(wěn)定性和微量mRNA回收困難可能是導致實驗未能獲得陽性結(jié)果的一個重要原因;雖然大容量天然人源核糖體展示scFv文庫中沒有偏好性,可以篩選到針對各種抗原的抗體,但是天然抗體文庫中的抗體親和力遠低于免疫文庫,這種差異可能會增加篩選到特定抗體的技術(shù)難度。⑵由于噬菌體抗體文庫是通過輔助噬菌體感染具有性菌毛的大腸桿菌使基因工程抗體以融合蛋白的形式展示在噬菌體表面,在篩選環(huán)境中有大量的細菌LPS存在,當噬菌體抗體庫與LBP孵育時,LBP結(jié)合LPS而引起的抗原表位改變可能是導致噬菌體展示scFv未能篩選到針對LBP抗原表位的anti-LBP陽性克隆的關(guān)鍵原因。⑶本實驗中抗原包被濃度均低于文獻報道的抗原包被濃度,有可能引起抗體篩選困難。在本實驗中兩種文庫篩選技術(shù)均未能成功篩選到有效的anti-LBP基因工程抗體克隆,提示不同實驗條件下,核糖體展示抗體庫和噬菌體展示抗體庫技術(shù)針對不同的抗原篩選特異性抗體存在一定的局限性。在選擇合適的抗體庫技術(shù)進行基因工程抗體設(shè)計和開發(fā)研究時要考慮抗原和實驗條件等制約因素以及出現(xiàn)陰性篩選結(jié)果的可能性。 3.利用原核表達載體表達純化了N-末端LBP融合蛋白,經(jīng)Western Blot檢測證實大腸桿菌BL21表達的N-末端LBP融合蛋白可以與抗人LBP多抗特異性結(jié)合,具有B細胞抗原表位。N-末端LBP融合蛋白的構(gòu)建和表達方法的建立為克服以人源重組全長LBP蛋白篩選抗體時購買商品化抗原成本高、周期長等不利因素提供了一種替代途徑;原核表達的N-末端LBP融合蛋白可用于抗體庫篩選時的起始抗原。
[Abstract]:Gene engineering antibody is one of the most widely used genetic engineering antibodies . The phage display or ribosome display technology can be used in the screening of high affinity scFv antibodies . Bacterial lipopolysaccharide ( LPS ) is one of the main components of endotoxin , which is one of the important causes of the death of patients with sepsis , sepsis , septic shock and multiple organ failure syndrome ( MODS ) caused by severe trauma , burn and Gram - negative bacilli infection . In this study , the recombinant human lbp protein was used as the antigen to screen anti - lbp gene engineering antibody by ribosome display and phage display technique , and it was hoped that the scFv modified by the screening was transformed into a more stable small molecule antibody ( such as disulfied stabilized Fv , dsFv ) , which was used to antagonise the amplification effect on the inflammatory response of the bp molecule and provide theoretical basis and inspiration for further study on the mechanism of pathogenic endotoxin and the prevention and control measures . The work of this study was carried out in three areas : 1 . A large capacity natural human scFv library was constructed by adding 5 - terminal T7 promoter , stem ring structure , ribosome binding site and 3 - terminal 6 脳 His tag , spacer sequence ( gene 鈪，

本文編號：1473170