本文關(guān)鍵詞： TBX5 GLI1 心手綜合征 生物信息學(xué)　出處：《中國(guó)醫(yī)科大學(xué)》2008年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】： 前言 TBX5是T-box轉(zhuǎn)錄因子家族成員之一,編碼518個(gè)氨基酸,在胚胎心臟和發(fā)育中的肢體組織中表達(dá),并且在正常心臟和肢體發(fā)育中起重要作用。TBX5基因突變可引起心手綜合征,后者是以先天性心臟和上肢畸形為特點(diǎn)的常染色體顯性遺傳病。大多數(shù)發(fā)生在TBX5羧基端的突變引起心手綜合征的分子機(jī)制尚不清楚,而且,TBX5羧基端的轉(zhuǎn)錄激活機(jī)制在很大程度上未知。因此,TBX5羧基端序列特征的研究對(duì)探索突變引起的心手綜合征致病分子機(jī)制和闡明TBX5的轉(zhuǎn)錄激活作用很有必要。目前已知,TBX5與其它心臟發(fā)育相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子GATA4和NKx2-5存在相互作用。研究表明,發(fā)生于TBX5蛋白的G80R,R237Q和R237W突變可減低TBX5與靶基因的DNA結(jié)合能力,導(dǎo)致TBX5對(duì)靶基因的轉(zhuǎn)錄激活水平降低,并且喪失了與NKx2-5的協(xié)同轉(zhuǎn)錄激活功能;TBX5蛋白的G80R和R237W錯(cuò)義突變可干擾與人類心臟間隔缺損相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子GATA4的相互作用,而Q49K、I54T、G169R和S252I突變則不具有這種作用。因此,進(jìn)一步確定是否還存在與TBX5相互作用的其它蛋白,對(duì)于揭示人類心臟發(fā)育機(jī)制和先天性心臟病發(fā)病機(jī)制具有重要意義。 與TBX5同屬于轉(zhuǎn)錄因子的GLI1蛋白介導(dǎo)Hedgehog通路,在果蠅和脊椎動(dòng)物胚胎發(fā)育中起關(guān)鍵作用。GLI1蛋白含有兩個(gè)已知的結(jié)構(gòu)域,即鋅指蛋白區(qū)域和假定的轉(zhuǎn)錄抑制子SFP1區(qū)域。最近報(bào)道并命名了GLI1氨基端中一段富含絲氨酸的N-端調(diào)控區(qū),它在GLI/Ci家族中高度保守,功能未明。盡管如此,對(duì)GLI1蛋白氨基端的序列-功能研究仍然很少,并且該序列對(duì)GLI1轉(zhuǎn)錄活性的影響也不清楚。據(jù)報(bào)道,大約三分之一的致死性腫瘤與Hedgehog通路成員突變或者對(duì)Hedgehog配體過(guò)度反應(yīng)引起Hedgehog過(guò)度激活有關(guān),而GLI1介導(dǎo)Hedgehog通路,在其中起重要作用。GLI1過(guò)表達(dá)與許多腫瘤發(fā)生有關(guān),例如,膠質(zhì)瘤,黑色素瘤,前列腺癌,食道鱗狀細(xì)胞癌和胃癌。目前的許多抗腫瘤藥物均以信號(hào)傳導(dǎo)通路中關(guān)鍵的激酶為靶點(diǎn)。MEK、PI3K抑制劑具有應(yīng)用于臨床治療腫瘤的前景,但由于其特異地抑制MEK、PI3K通路,可能存在著一定的不可預(yù)見的毒副作用,并未全面開展其臨床實(shí)驗(yàn)研究。因此,掌握MEK、PI3K抑制劑對(duì)腫瘤細(xì)胞中某些腫瘤相關(guān)蛋白的表達(dá)和細(xì)胞侵襲力的影響,將為MEK、PI3K抑制劑應(yīng)用于腫瘤臨床治療提供理論基礎(chǔ)。 方法 一、實(shí)驗(yàn)材料 1、全部物種蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?db=proteincmd=searchterm= 2、人類非冗余數(shù)據(jù)庫(kù)(Non-redundant Database)http://www.ncbi.nlm.nih.gov/RefSeq/ 3、PSI-BLAST(位置特異性疊代BLAST)網(wǎng)址PSI-BLAST:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi 4、FFAS03(折疊和功能預(yù)測(cè)系統(tǒng))網(wǎng)址FFAS03:http://ffas.ljcrf.edu/ffas-cgi/cgi/ffas.pl 5、HHpred(隱馬爾科夫模型的同源檢測(cè)和結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè))網(wǎng)址:HHpred:http://toolkit.tuebingen.mpg.de/hhpred 6、比對(duì)軟件M-Coffee:M-Coffee:http://tcoffee.vital-it.ch/cgi-bin/Tcoffee/tcoffee_cgi/index.cgi 7、蛋白磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)軟件PredPhospho:PredPhospho:http://pred.ngri.re.kr/PredPhospho.htm 8、昆明種小白鼠由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部提供 9、胃癌細(xì)胞SGC7901 人胃癌細(xì)胞SGC7901常規(guī)在1640培養(yǎng)基(10%胎牛血清,含青霉素及鏈霉素)中,于37℃、5%CO_2及飽和濕度的條件下培養(yǎng)。 10、MEK、PI3K抑制劑 MEK抑制劑U0126(Camarillo,San Diego,CA)濃度12.51μM,PI3K抑制劑LY29400(Calbiochem,San Diego,CA)濃度25μM。以DMSO溶解以上兩種抑制劑。 二、實(shí)驗(yàn)方法 1、應(yīng)用PSI-BLAST、FFAS03、HHpred生物信息學(xué)同源檢測(cè)工具對(duì)非冗余數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行TBX5、GLI1同源蛋白檢測(cè)。 2、采用M-Coffee進(jìn)行不同物種TBX5、GLI1蛋白的多重比對(duì)。 3、采用PredPhospho進(jìn)行TBX5羧基端、GLI1氨基端磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)。 4、提取小鼠心肌組織核蛋白以TBX5為抗體進(jìn)行免疫沉淀,目的條帶進(jìn)行質(zhì)譜鑒定。應(yīng)用核蛋白提取試劑盒(Pierce)提取核蛋白。采用Pierce免疫共沉淀試劑盒#23600進(jìn)行免疫沉淀。實(shí)驗(yàn)組:有活性gel+15μl Tbx5多克隆抗體,對(duì)照組:無(wú)活性gel+15μl Tbx5多克隆抗體,IgG組:有活性gel+5μl IgG,分別加入20μl小鼠心肌組織核蛋白進(jìn)行免疫沉淀。 5、質(zhì)譜分析確定目的蛋白后,應(yīng)用Western印跡雜交驗(yàn)證免疫共沉淀蛋白的相互作用。 6、胃癌細(xì)胞SGC7901分組及處理 實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組(正常培養(yǎng)的胃癌SGC7901細(xì)胞)、DMSO組(在4ml培養(yǎng)基中加入2μl DMSO),以及MEK抑制劑組(濃度12.5μM)、PI3K抑制劑組(濃度25μM)和一組兩種抑制劑共同作用組(MEK抑制劑與PI3K抑制劑共同作用,濃度同上),共5組。 7、應(yīng)用RT-PCR和Western印跡雜交分別檢測(cè)MEK、PI3K抑制劑作用第0、12、24、48、72小時(shí)胃癌SGC7901細(xì)胞中GLI1基因和GLI1蛋白表達(dá)水平。 8、流式細(xì)胞儀檢測(cè)MEK、PI3K抑制劑作用第12、24、48、72小時(shí)胃癌SGC7901細(xì)胞表面受體CD44、CD14和TLR2的表達(dá)。 9、Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)MEK和PI3K抑制劑作用第12、24、48、72小時(shí),對(duì)胃癌SGC7901細(xì)胞體外侵襲能力的影響。 結(jié)果 1、TBX5羧基端、GLI1氨基端與酵母DNA指導(dǎo)的RNA聚合酶Ⅱ最大亞基羧基端結(jié)構(gòu)域具有顯著同源性。 2、TBX5羧基端Tyr291和Tyr342是潛在的磷酸化位點(diǎn),而GLI1氨基端Ser84和Ser102殘基是潛在的磷酸化位點(diǎn)。 3、小鼠心肌Tbx5蛋白與α-肌球蛋白重鏈(Myh6)相互作用。 4、Western Blot驗(yàn)證小鼠Tbx5與α-肌球蛋白重鏈存在相互作用。 5、MEK、PI3K抑制劑,在作用第48、72小時(shí)使胃癌SGC7901細(xì)胞中GLI1基因和GLI1蛋白表達(dá)水平降低。 6、MEK和PI3K抑制劑在作用第72小時(shí)使胃癌SGC7901細(xì)胞中CD44表達(dá)下調(diào),兩者具有協(xié)同作用。 7、MEK和PI3K抑制劑在作用第72小時(shí)使胃癌SGC7901細(xì)胞中CD14表達(dá)下調(diào),兩者具有協(xié)同作用。 8、MEK和PI3K抑制劑,單獨(dú)或聯(lián)合使用,在作用第12至72小時(shí),均未對(duì)胃癌SGC7901細(xì)胞中TLR2表達(dá)水平有明顯的影響。 9、MEK和PI3K抑制劑,單獨(dú)或聯(lián)合使用,在作用第72小時(shí)使胃癌SGC7901細(xì)胞體外侵襲能力下降。 結(jié)論 1、TBX5羧基端殘基267-448以及GLI1氨基端殘基2-175均與酵母DNA指導(dǎo)的RNA聚合酶Ⅱ最大亞基羧基端結(jié)構(gòu)域高度同源。 2、TBX5羧基端的部分功能可能是通過(guò)與其它蛋白相互作用或募集其它蛋白,發(fā)揮轉(zhuǎn)錄活性。GLI1氨基端高度保守的Ser84和Ser102殘基是潛在的PKA和/或PKC磷酸化位點(diǎn)。 3、小鼠心肌Tbx5蛋白與α-肌球蛋白重鏈(Myh6)存在相互作用。 4、MEK和PI3K抑制劑作用第48、72小時(shí)使胃癌SGC7901細(xì)胞中GLI1基因和GLI1蛋白表達(dá)下降。 5、MEK和PI3K抑制劑在第72小時(shí)使胃癌SGC7901細(xì)胞中CD44、CD14表達(dá)水平明顯下降,并且兩者存在協(xié)同作用。MEK、PI3K抑制劑,單獨(dú)或聯(lián)合使用,均對(duì)胃癌SGC7901細(xì)胞中TLR2的表達(dá)無(wú)影響。 6、MEK和PI3K抑制劑,單獨(dú)或聯(lián)合使用,在作用第72小時(shí)使胃癌SGC7901細(xì)胞體外侵襲能力下降。
[Abstract]:Preface
TBX5 is one of the T-box transcription factor family, encoding 518 amino acids, is expressed in the embryonic heart and development in body tissues, and play an important role of.TBX5 gene mutation can cause Holt Oram syndrome in normal heart and limb development, which is based on congenital heart and limb malformation characterized by autosomal dominant genetic disease most TBX5 mutations at the carboxyl terminus of the molecular mechanism of heart syndrome caused by unclear, moreover, the transcription of TBX5 C-terminal activation mechanism is largely unknown. Therefore, studies on the transcription of TBX5 C-terminal sequences to explore mutations cause Holt Oram syndrome and elucidate the molecular mechanisms of TBX5 activation is necessary. It is now known that TBX5 and other heart development related transcription factor GATA4 and NKx2-5 interaction. The results show that in TBX5 protein G80R, R237Q and R237W mutations can be reduced 浣嶵BX5涓庨澏鍩哄洜鐨凞NA緇撳悎鑳藉姏,瀵艱嚧TBX5瀵歸澏鍩哄洜鐨勮漿褰曟縺媧繪按騫抽檷浣，

本文編號(hào)：1472944