本文關(guān)鍵詞： CD4+CD25+CD127low調(diào)節(jié)性T細(xì)胞 血漿Exosomes小體 Wnt信號(hào)通路 B淋巴細(xì)胞 體外擴(kuò)增 增殖抑制　出處：《復(fù)旦大學(xué)》2010年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】： 1.通過將人血漿Exosomes小體、重組Wnt分子分別與人外周血CD4+CD25+CD1271ow調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Regulatory T Cells, Treg)作用,觀察Treg細(xì)胞在體外的存活情況及其Wnt信號(hào)通路的變化。 2.通過將同種異基因人外周血B淋巴細(xì)胞體外擴(kuò)增Treg細(xì)胞,觀察Treg細(xì)胞擴(kuò)增前后在數(shù)量上的變化及表型和功能是否改變,建立體外擴(kuò)增Treg細(xì)胞的有效方法,并與樹突細(xì)胞(dendritic cell, DC)擴(kuò)增Treg細(xì)胞的方法相比較。 1.應(yīng)用免疫磁珠分離方法分離純化人外周血CD4+CD25+CD1271owTreg細(xì)胞,將Wnt分子和從多個(gè)健康供者血漿中分離得到的Exosomes小體分別加入到Treg細(xì)胞中,加入人白介素2(IL-2,50U/ml)。利用RT-PCR檢測共培養(yǎng)12h后Wnt信號(hào)通路涉及的凋亡相關(guān)基因的改變,同時(shí)采用流式技術(shù)檢測Wnt信號(hào)通路中磷酸化β-catenin水平的改變,并在共培養(yǎng)14天后采用流式技術(shù)檢測各組細(xì)胞的凋亡情況。設(shè)立未經(jīng)處理的Treg細(xì)胞組為對(duì)照組。 2.將異體健康供者外周血分離得到的B淋巴細(xì)胞與磁珠分選得到的Treg細(xì)胞共孵育,用IL-2(IOOU/ml)和CD28單抗(500ng/ml)共同刺激,在培養(yǎng)14天的過程中通過流式檢測Treg細(xì)胞表型的變化,同時(shí)與樹突狀細(xì)胞擴(kuò)增Treg細(xì)胞的方法相比較(培養(yǎng)條件相同)。14天培養(yǎng)結(jié)束后,將細(xì)胞與CFSE處理過的經(jīng)強(qiáng)刺激(加入CD3單抗500ng/ml,IL-2300U/ml)的CD4+效應(yīng)性T細(xì)胞共培養(yǎng),在第五天通過流式檢測Treg細(xì)胞對(duì)CD4+T細(xì)胞的增殖抑制,設(shè)立只經(jīng)強(qiáng)刺激的CFSE處理過的CD4+T細(xì)胞為對(duì)照組。 1.通過RT-PCR分析純化的Treg細(xì)胞上的Frizzled(FRZ)受體及低密度脂蛋白相關(guān)蛋白5(LRP5)和LRP6的基因表達(dá),結(jié)果顯示Treg細(xì)胞表達(dá)FRZ2、3、4,LRP6基因,通過Western Blotting技術(shù)檢測血漿中Exosomes小體上Wnt3a和Wnt5a的蛋白表達(dá),均有條帶出現(xiàn)。共培養(yǎng)12h后,RT-PCR檢測凋亡相關(guān)基因Bcl-xL、Bcl-2、c-Myc的表達(dá),結(jié)果顯示Treg細(xì)胞與血漿exosomes樣小體或Wnt分子共培養(yǎng)時(shí),抗凋亡基因Bcl-2相對(duì)于對(duì)照組均有明顯的上調(diào),另一抗凋亡基因Bcl-xL和誘導(dǎo)凋亡的基因c-Myc無明顯變化。培養(yǎng)14天后,通過流式檢測凋亡,加入Exosomes樣小體或Wnt分子的Treg細(xì)胞生存率均比對(duì)照組高。 2.經(jīng)B細(xì)胞聯(lián)合IL-2和CD28單抗刺激的Treg細(xì)胞在培養(yǎng)14天后流式檢測Foxp3和CD4/CD25,陽性率均很高,此時(shí)計(jì)數(shù)Treg細(xì)胞為最初數(shù)量的20倍。利用CFSE檢測技術(shù),將擴(kuò)增14天的Treg細(xì)胞與CD3單抗和IL-2強(qiáng)刺激的CD4+T細(xì)胞共培養(yǎng),5天后流式檢測,擴(kuò)增后的Treg細(xì)胞能夠有效地抑制CD4+T細(xì)胞的增殖功能。 1.初步判斷Wnt信號(hào)通路能夠影響Treg細(xì)胞的生存狀態(tài),血漿Exosomes小體能夠延長Treg細(xì)胞的生存時(shí)間,其中Exosomes小體攜帶Wnt分子與Treg細(xì)胞上的Frizzled受體作用可以活化Treg細(xì)胞的Wnt信號(hào)通路,在提高Treg細(xì)胞的生存率方面起了一定的作用,即血漿Exosomes小體可能通過Wnt信號(hào)通路途徑影響Treg細(xì)胞的存活。 2.同種異基因B淋巴細(xì)胞能夠在體外有效的擴(kuò)增人外周血Treg細(xì)胞,擴(kuò)增效率可達(dá)20倍以上,并且能顯著抑制CD4+T細(xì)胞的增殖。
[Abstract]:1., we observed the survival of Treg cells in vitro and the changes of Wnt signaling pathway through the action of human plasma Exosomes bodies and recombinant Wnt molecules on CD4+CD25+CD1271ow regulatory T cells (Regulatory T Cells, Treg), respectively.
2. by allogeneic peripheral blood B lymphocytes in vitro amplification of Treg cells, Treg cells were observed before and after expansion in the number of changes and phenotypic and functional changes in the effective method to establish the amplification of Treg cells in vitro, and dendritic cells (dendritic cell, DC) compared with amplification of Treg cells.
Separation and purification of CD4+CD25+CD1271owTreg cells from peripheral blood of 1. application of immunomagnetic separation method, the isolated plasma Wnt molecules and from multiple healthy donors in Exosomes bodies were added to Treg cells, adding human interleukin 2 (IL-2,50U/ml). RT-PCR is used to detect the co culture of 12h Wnt pathway involved in apoptosis related genes. At the same time, using flow cytometry to detect phosphorylation of Wnt signaling pathway in the beta -catenin level changes, and after 14 days of CO cultivation with apoptosis was detected by flow cytometry. The cells were set up without Treg cell group treatment as control group.
2. healthy allogeneic donor peripheral blood B lymphocytes were isolated and multisort obtained Treg cells incubated with IL-2 monoclonal antibody (IOOU/ml) and CD28 (500ng/ml) Co stimulation, by changing the flow cytometry phenotype of Treg cells during the 14 day culture, compared the simultaneous amplification of Treg cells and dendritic cells (cultured in the same conditions).14 days after culture, the cells treated with CFSE by strong stimulation (adding CD3 mAb 500ng/ml, IL-2300U/ml) co cultured CD4+ effector T cells, Treg cells were detected by flow type CD4 on +T cells proliferation in fifth days, set up by only CFSE strong stimulation of CD4+T cells as the control group.
1. through RT-PCR analysis of purified Treg cell Frizzled (FRZ) and low density lipoprotein receptor related protein 5 (LRP5) and expression of LRP6 gene, the results showed that Treg FRZ2,3,4 expression of LRP6 gene was detected by Exosomes, plasma Western Blotting technology on Wnt3a and Wnt5a were both protein expression bands. Co culture 12h, RT-PCR detection of apoptosis related gene Bcl-xL, Bcl-2, c-Myc expression showed that Treg cells were co cultured with plasma exosomes like bodies or Wnt molecules, the anti apoptotic gene Bcl-2 was significantly up-regulated compared with the control group, another anti apoptotic gene Bcl-xL and apoptosis gene c-Myc had no obvious change. Culture 14 days later, apoptosis by flow cytometry, adding Exosomes like bodies or Wnt molecules Treg cell survival rate were higher than the control group.
2. after B cells combined with IL-2 and CD28 monoclonal antibody stimulated Treg cells cultured for 14 days in flow cytometry detection of Foxp3 and CD4/CD25, the positive rate is very high, the Treg cell count was 20 times the original number. The use of CFSE detection technology, the amplification of 14 days of Treg cells with CD3 monoclonal antibody and IL-2 strong stimulation of CD4 +T cells after 5 days of co culture, flow cytometry, expanded Treg cells can effectively inhibit the proliferation of CD4+T cells.
1. preliminary judgment can Wnt pathway affects the survival of Treg cells, plasma Exosomes bodies can prolong the survival time of Treg cells, Wnt signaling pathway in which Exosomes bodies carry Frizzled receptors and Wnt molecule on Treg cells can activate Treg cells, play a role in improving the survival rate of Treg cells, namely plasma Exosomes bodies may through Wnt signal pathway. The influence of Treg cell survival.
2. allogeneic B lymphocytes can effectively amplify human peripheral blood Treg cells in vitro, the amplification efficiency can be more than 20 times, and can significantly inhibit the proliferation of CD4+T cells.

【學(xué)位授予單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號(hào)】：R392

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