本文關(guān)鍵詞： p100 G3BP 蛋白質(zhì)相互作用 應(yīng)激顆粒 mRNA代謝 加工體　出處：《天津醫(yī)科大學(xué)》2009年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：目的：p100蛋白是一種多功能蛋白,是基因轉(zhuǎn)錄和pre-mRNA剪接加工的雙重調(diào)控因子,由4個(gè)重復(fù)的葡萄球菌核酸酶同源性結(jié)構(gòu)域SN片段和隨后的Tudor-SN (TSN)結(jié)構(gòu)域構(gòu)成。本課題小組在前期的工作中利用p100蛋白作為誘餌釣取可以與之結(jié)合的蛋白時(shí)釣到了G3BP蛋白。由此,我們提出疑問：p100蛋白與G3BP蛋白之間的結(jié)合是在某一種特定的環(huán)境下偶然地存在還是一種穩(wěn)定的細(xì)胞內(nèi)結(jié)合?兩種蛋白之間是直接結(jié)合還是需要其他的輔助成分進(jìn)行橋接?與結(jié)合有關(guān)的結(jié)構(gòu)區(qū)域各位于兩種蛋白質(zhì)的哪一個(gè)部分?為了解決這些疑問,我們開展了關(guān)于p100蛋白與G3BP蛋白之間的相互結(jié)合的研究工作,并對(duì)結(jié)合后的潛在功能進(jìn)行了初步的探討。 方法： 第一部分：p100蛋白與G3BP蛋白的結(jié)合研究。首先利用p100蛋白不同片段的GST融合蛋白釣取細(xì)胞內(nèi)過表達(dá)的G3BP蛋白以確認(rèn)我們前期研究工作中發(fā)現(xiàn)的二者之間的結(jié)合關(guān)系。為了確定二者之間的結(jié)合關(guān)系是否穩(wěn)定,通過細(xì)胞內(nèi)過表達(dá)的p100蛋白與G3BP蛋白之間及細(xì)胞內(nèi)源性p100蛋白與G3BP蛋白之間的免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)再次印證實(shí)驗(yàn)一的結(jié)果。最后利用免疫熒光實(shí)驗(yàn)觀察二者在細(xì)胞內(nèi)的定位情況。 第二部分：p100蛋白與G3BP蛋白相互結(jié)合的功能片段的確定。首先根據(jù)G3BP的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)構(gòu)建了表達(dá)G3BP不同結(jié)構(gòu)域的GST-G3BP片段融合蛋白表達(dá)質(zhì)粒和用于體外翻譯的帶有T7啟動(dòng)子的pcDNA3.1(+)-G3BP質(zhì)粒。然后通過GST-Pull Down方法用GST-G3BP片段1-5融合蛋白體外翻譯的p100蛋白,放射白顯影的方法觀察結(jié)果。反之,利用GST-p100片段融合蛋白釣取體外翻譯的G3BP蛋白,從而確定二者之間相互結(jié)合的功能片段。為了進(jìn)一步驗(yàn)證我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果,重復(fù)GST-pullDown實(shí)驗(yàn)部分,不同之處在于用GST融合蛋白釣取細(xì)胞內(nèi)過表達(dá)的蛋白質(zhì),Western Blot方法檢測(cè)。 第三部分：p100蛋白與G3BP蛋白結(jié)合后的功能探討。通過免疫免疫熒光方法觀察共轉(zhuǎn)染pEGFP-CI-G3BP與pRFP-p100/p100-SN/p100-TSN質(zhì)粒的HeLa細(xì)胞給予亞砷酸鹽刺激或熱休克刺激后,兩種蛋白質(zhì)在細(xì)胞中的共定位情況,并確定共定位的功能片段。同時(shí)研究p100蛋白與G3BP蛋白結(jié)合后對(duì)細(xì)胞內(nèi)mRNA代謝的影響：將COS7細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染p100或G3BP或共轉(zhuǎn)p100與G3BP質(zhì)粒,給予亞砷酸鹽或45℃熱休克刺激后觀察細(xì)胞內(nèi)RNA降解情況。 結(jié)果： 第一部分：無論是細(xì)胞內(nèi)源性p100蛋白與G3BP蛋白之間還是細(xì)胞內(nèi)過表達(dá)的p100蛋白與G3BP蛋白質(zhì)之間都可以發(fā)生共沉淀,表明p100蛋白和G3BP蛋白可以穩(wěn)定結(jié)合。在轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞內(nèi)觀察到p100蛋白與G3BP蛋白在細(xì)胞內(nèi)的定位基本一致,主要分布于胞漿內(nèi),少量p100蛋白分布于胞核內(nèi)。 第二部分：p100蛋白的SN片段可以與G3BP蛋白的多個(gè)片段結(jié)合,包括NTF2-like片段、PxxP模序、RRM片段,RGG片段結(jié)合不穩(wěn)定。而p100蛋白的TSN片段和TD片段及G3BP蛋白的酸性氨基酸富集區(qū)片段則與二者之間的結(jié)合無關(guān)。 第三部分：轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞給予亞砷酸鹽刺激或熱休克刺激后,胞漿內(nèi)開始出現(xiàn)綠色和紅色的熒光顆粒,二種熒光顆粒在胞漿中的定位基本一致。隨著刺激時(shí)間的延長(zhǎng),顆粒的數(shù)量和體積不斷發(fā)生變化。P100蛋白的SN片段在細(xì)胞內(nèi)可形成與G3BP共定位的顆粒,而TSN片段和空載體pEGFP-CI和pRFP在胞漿內(nèi)不能形成明顯的顆粒狀結(jié)構(gòu)。熱休克刺激去除后,顆粒的數(shù)量和體積有一定的減少,其中紅色顆粒的消散比較明顯。 細(xì)胞轉(zhuǎn)染了p100或G3BP或共轉(zhuǎn)p100與G3BP后,細(xì)胞內(nèi)提取到RNA與未轉(zhuǎn)染細(xì)胞之間無明顯差異。各組細(xì)胞在給予亞砷酸鹽或45℃熱休克前后的RNA代謝情況也未有明顯差異。 結(jié)論：通過研究證實(shí),G3BP與p100蛋白在細(xì)胞內(nèi)、外均可結(jié)合,不需要輔助因子的參與。二者之間的結(jié)合是由G3BP的NTF2-like片段、PxxP模序、RRM片段和p100蛋白的SN片段介導(dǎo)的。應(yīng)激狀態(tài)下,p100蛋白與G3BP蛋白共同參與了應(yīng)激顆粒的形成,介導(dǎo)p100蛋白進(jìn)入應(yīng)激顆粒的是SN片段。
[Abstract]:Objective: P100 protein is a multifunctional protein that is a dual regulator of gene transcription and pre-mRNA splicing, by 4 repeated staphylococcal nuclease homology domain fragment of SN and subsequent Tudor-SN (TSN) domain. The research team in previous work using P100 protein as bait for fishing can be combined with the protein caught G3BP protein. Thus, we ask: binding between P100 protein and G3BP protein in a particular environment or occasionally a stable intracellular binding? Two proteins between the direct binding or other auxiliary components need to be bridged? And which part of the structure of regional related in two proteins? In order to solve these questions, we carried out on P100 protein and G3BP protein in the combination of research work, and the node The potential function of the post closure was preliminarily discussed.
Method錛，

本文編號(hào)：1467349