本文關(guān)鍵詞： 軟骨組織工程 BMSCs ChM-I 血管化 腺病毒　出處：《西北大學》2010年碩士論文　論文類型：學位論文

【摘要】： 研究背景： 骨髓間充質(zhì)干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)是軟骨組織工程中倍受關(guān)注的種子細胞,具有很高的研究意義和廣泛的應(yīng)用前景。但應(yīng)用BMSCs構(gòu)建的軟骨組織經(jīng)體內(nèi)長期移植后,會發(fā)生一系列表型不穩(wěn)定現(xiàn)象,比如喪失表達Ⅱ型膠原的能力,這些嚴重地影響利用BMSCs進行軟骨缺損的長期修復效果。這一系列表型變化現(xiàn)象類似于軟骨內(nèi)骨化的發(fā)生過程,即軟骨組織先出現(xiàn)肥大、鈣化現(xiàn)象,并伴隨有血管的侵入,隨著體內(nèi)移植時間的增長血管化程度逐漸增加,漸漸礦化形成骨組織。該過程中血管化的侵入是誘導軟骨向骨轉(zhuǎn)變的關(guān)鍵步驟。然而正常的軟骨組織在促血管發(fā)生的微環(huán)境中,仍可持續(xù)保持無血管的狀態(tài)及穩(wěn)定的軟骨表型,經(jīng)研究發(fā)現(xiàn),其中存在的一種特異性的生長因子——軟骨調(diào)節(jié)素-1(Chondromodulin-I, ChM-I),具有強效的抑制血管發(fā)生的功能。我們推測BMSCs在分化為軟骨的過程中ChM-I不表達或者表達很低,從而才會導致血管侵入、軟骨表型丟失現(xiàn)象的發(fā)生。目前,對BMSCs及其分化形成的軟骨中ChM-Ⅰ是否表達尚無文獻報道。因此,我們從ChM-I基因在BMSCs和軟骨細胞中是否存在表達差異出發(fā),研究ChM-I對BMSCs體內(nèi)構(gòu)建的軟骨血管化的抑制作用,分析其在軟骨表型丟失過程的影響。 實驗目的： 觀察軟骨細胞對BMSCs體內(nèi)構(gòu)建軟骨的血管化的抑制作用,對比抗血管生成因子ChM-I的基因在兩種細胞間的表達差異,并探討ChM-I抑制BMSCs體內(nèi)構(gòu)建軟骨血管化的作用,為改善和提高BMSCs來源的軟骨組織的表型穩(wěn)定性提供新的思路。 實驗方法和結(jié)果： 1. BMSCs與軟骨細胞以不同比例(3：1,1：1,1：3)混合,接種至珊瑚材料上,移植到裸鼠皮下,同時分別以單純BMSCs和軟骨細胞為陰性和陽性對照組,體內(nèi)培養(yǎng)1-2個月后,觀察構(gòu)建的組織工程軟骨的血管化程度,并分析抗血管生成因子ChM-I在不同組中的表達分布。大體觀察和組織學結(jié)果可見,單純BMSCs構(gòu)成的組織中血管化程度很高,而且有少量成骨出現(xiàn)。相反,含有軟骨細胞的各實驗組均可形成血管化程度極低的軟骨組織,在軟骨細胞含量很少(25%)時也可保持很低的血管化水平。免疫熒光結(jié)果顯示,ChM-I在陽性對照組及各個實驗組都有不同程度的表達分布,而單純BMSCs構(gòu)成的組織中沒有。 2.用RT-PCR的方法比較ChM-I基因在BMSCs和關(guān)節(jié)軟骨細胞之間的表達差異。結(jié)果顯示ChM-I在BMSCs中幾乎不表達,此外,兩種細胞之間Ⅱ型膠原和蛋白聚糖的表達也存在顯著的差異。 3.獲得兔ChM-I基因克隆,構(gòu)建重組腺病毒Ad5-ChM-I。用RT-PCR的方法從兔的關(guān)節(jié)軟骨組織中獲得了ChM-I基因克隆,通過測序驗證了其正確性,并成功的構(gòu)建了高滴度的重組腺病毒Ad5-ChM-I。 4.轉(zhuǎn)染重組腺病毒Ad5-ChM-I的BMSCs與珊瑚材料復合物移植到裸鼠皮下1-2個月后,觀察體內(nèi)構(gòu)建的軟骨組織的血管化的程度,分析軟骨表型的變化。大體觀察和組織學結(jié)果可見,轉(zhuǎn)染Ad5-ChM-I的BMSCs在體內(nèi)形成的軟骨組織的血管化程度很低,免疫熒光結(jié)果顯示,ChM-I在轉(zhuǎn)染后的BMSCs形成的組織中有一定的表達分布。 結(jié)論： 研究結(jié)果表明,ChM-I基因在BMSCs和軟骨細胞中確實存在顯著的表達差異,BMSCs中幾乎不表達ChM-I,軟骨細胞及其特異性表達的ChM-I均可以抑制BMSCs體內(nèi)構(gòu)建的軟骨組織的血管化發(fā)生,阻止其向骨的表型發(fā)生轉(zhuǎn)變,在一定程度上穩(wěn)定了軟骨表型。因此,我們可以將腺病毒介導的ChM-I基因修飾的BMSCs作為新型的種子細胞,用于構(gòu)建穩(wěn)定的無血管侵入的組織工程軟骨,或者用于軟骨缺損修復之中,達到長期的治療效果。
[Abstract]:Research background:
Bone marrow mesenchymal stem cells (bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs) is the focus of seed cells in cartilage tissue engineering, has high research value and broad application prospect. But the application of BMSCs construction of the cartilage after long-term in vivo transplantation can produce a series of phenotypic instability, such as the loss of the ability to express type II collagen, which seriously affected the long-term effect of the repair of cartilage defect by BMSCs. During this series of phenotypic changes similar to the phenomenon of endochondral ossification, namely cartilage tissue appeared hypertrophy, calcification and vascular invasion with, with the growth of vascularization in vivo transplantation time gradually increased gradually the mineralization of bone tissue formation. In the process of vascular invasion is a key step to induce cartilage bone transformation. However, the normal cartilage tissue microenvironment in neovascularization in, Still keep the sustainable and stable state of avascular cartilage phenotype, the study found that the presence of a specific growth factor -- chondromodulin -1 (Chondromodulin-I, ChM-I), a potent inhibition of vascular function. We speculate that the occurrence of BMSCs in the process of differentiation into cartilage in ChM-I expression or expression is very low thus, can lead to vascular invasion, occurrence of cartilage phenotype loss. At present, there is no report about whether the expression of ChM- 1 on the formation of BMSCs and differentiation of cartilage. Therefore, we from the ChM-I gene in BMSCs and chondrocytes in the existence of differences in expression of the inhibitory effect of ChM-I on cartilage vascularization in vivo construction of BMSCs the analysis, lost in the cartilage phenotype process.
Objective:
To observe the inhibitive effect of chondrocytes on chondrogenesis of BMSCs in vivo vascular contrast, anti angiogenic factor ChM-I gene in two cell differential expression and inhibitory effect of ChM-I on BMSCs in vivo cartilage angiogenesis in construction, to provide new ideas for improving and enhancing the phenotypic stability of cartilage tissue derived from BMSCs.
Experimental methods and results:
1. BMSCs and chondrocytes in different proportions (3:1,1:1,1:3) mixed inoculation to coral material, transplanted into nude mice, were pure BMSCs and cartilage cells as negative control group and positive control group cultured in vivo after 1-2 months, the degree of vascularization of tissue engineering cartilage construction observation, and analysis of the distribution of anti angiogenic factor the expression of ChM-I in different groups. The general observation and vascular tissue visible, highly pure BMSCs tissues, and have a small amount of bone. On the contrary, each experimental group can contain chondrocytes in the cartilage formation of blood vessels is extremely low, rarely in the cartilage cell content (25%) also can maintain a very low level of vascularization. Immunofluorescence results showed that ChM-I has a distribution of different degrees of expression in the positive control group and the experimental group, and a simple BMSCs organization.
2., the expression difference of ChM-I gene between BMSCs and articular chondrocytes was compared by RT-PCR. Results showed that ChM-I was almost not expressed in BMSCs, and there was significant difference in the expression of type II collagen and proteoglycan between two kinds of cells.
3. the rabbit ChM-I gene was cloned, and the recombinant adenovirus Ad5-ChM-I. was constructed. The ChM-I gene clone was obtained from rabbit articular cartilage tissue by RT-PCR. The correctness of the gene was verified by sequencing, and the recombinant adenovirus Ad5-ChM-I. with high titer was successfully constructed.
BMSCs and coral composites 4. transfected with recombinant adenovirus Ad5-ChM-I transplanted into nude mice after 1-2 months, the construction of cartilage tissue in vivo vascularization, changes of cartilage phenotype. The gross observation and tissue vascularization of cartilage tissue, Ad5-ChM-I transfected BMSCs is formed in the body is low immunofluorescence results showed that the formation of ChM-I in transfected BMSCs tissues have a certain distribution of expression.
Conclusion:
The results showed that the ChM-I gene indeed significant differential expression in BMSCs and chondrocytes, BMSCs almost no expression of ChM-I, ChM-I and chondrocyte specific expression could inhibit cartilage tissue BMSCs in vivo construction of vascularization, prevent the changes to the table type bone, to a certain extent, the stability of the cartilage phenotype. Therefore, we can use the ChM-I gene modified adenovirus mediated BMSCs as a new source of seed cells for cartilage tissue engineering, without vascular invasion to construct stable, or for the repair of cartilage defects, to achieve the long-term therapeutic effect.

【學位授予單位】：西北大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2010
【分類號】：R329

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