本文關(guān)鍵詞： 淋病奈瑟菌 NspA PorB 免疫保護(hù)　出處：《揚(yáng)州大學(xué)》2008年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】： 淋病是由淋病奈瑟菌(Neisseria gonorrhoeae)感染引起的一種常見(jiàn)性傳播疾病(Sexual Transmitted Disease, STD),主要引起男性的急性尿道炎、前列腺炎、附睪炎;在女性主要表現(xiàn)為隱性感染,常因不能及時(shí)醫(yī)治而導(dǎo)致病菌向深部擴(kuò)散,引起盆腔炎、子宮內(nèi)膜炎、輸卵管炎,并能導(dǎo)致不孕癥。淋病發(fā)病率高,是當(dāng)前性病防治中的重點(diǎn)。由于淋病奈瑟菌容易對(duì)抗生素產(chǎn)生耐藥性,給淋病的治療帶來(lái)了新的問(wèn)題,因而加強(qiáng)疫苗研究對(duì)淋病防制工作具有重要意義。 淋病奈瑟菌疫苗研制歷經(jīng)艱難,二十世紀(jì)七十年代全細(xì)胞疫苗的人體試驗(yàn)遭遇失敗,研究的重點(diǎn)開(kāi)始轉(zhuǎn)向亞單位疫苗和基因疫苗等新型疫苗。菌毛是第一個(gè)被純化的淋病奈瑟菌亞單位成分,盡管純化后的菌毛能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生較高滴度的抗體,但是由于菌毛表面一些表位變異程度高,這些抗體并不具有顯著的免疫保護(hù)作用。同樣由于高度變異的原因,另一類重要粘附因子Opa蛋白在淋病疫苗研制中也受到了限制。 奈瑟菌表面蛋白A (Neisseria surface protein A, NspA)表達(dá)于所有淋病奈瑟菌菌株,高度保守,免疫原性強(qiáng)。本實(shí)驗(yàn)室的前期研究表明,重組真核表達(dá)載體pCNspA免疫小鼠產(chǎn)生了具有介導(dǎo)補(bǔ)體溶解淋病奈瑟菌作用的NspA特異性抗體�？椎鞍�(Porin)是淋病奈瑟菌的重要外膜蛋白,但是從菌體中純化孔蛋白極易污染Rmp蛋白,而Rmp蛋白的抗體能夠阻遏孔蛋白抗體的抗菌作用。高度純化的孔蛋白可以刺激動(dòng)物產(chǎn)生高滴度的保護(hù)性抗體。 本研究進(jìn)一步探索了NspA和孔蛋白B(Porin B, PorB)在淋病疫苗研制中的應(yīng)用前景。為了改進(jìn)基因免疫效價(jià)不高的缺陷,在基因免疫后用重組蛋白進(jìn)行加強(qiáng)免疫。構(gòu)建了NspA原核表達(dá)載體pQE31NspA。SDS-PAGE和Western-blotting檢測(cè)表明pQE31NspA可在大腸桿菌中高效表達(dá)重組蛋白NspA。rNspA經(jīng)Ni+-NTAPurification System純化,并通過(guò)透析復(fù)性。然后用本室前期構(gòu)建的NspA真核表達(dá)載體pCNspA基因免疫BALB/c小鼠。4次基因免疫后在小鼠血清中僅能檢測(cè)到1:200的NspA特異性IgG。用rNspA加強(qiáng)免疫1次后,NspA特異性IgG則提高到1:3200以上。但是仍然略低于完全以rNspA免疫小鼠血清中特異性抗體的效價(jià)�？贵w介導(dǎo)的補(bǔ)體溶淋病奈瑟菌實(shí)驗(yàn)和抗體調(diào)理吞噬實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,兩種方案獲得的免疫血清均表現(xiàn)出良好的抗淋病奈瑟菌作用;然而,免疫保護(hù)作用的強(qiáng)弱并不是與血清中特異性IgG水平相對(duì)應(yīng),抗體水平略低的基因免疫蛋白加強(qiáng)組血清表現(xiàn)出更強(qiáng)的抗菌作用。 為了避免Rmp蛋白的污染和提高基因免疫的效果,從Christopher博士惠贈(zèng)的PorB原核表達(dá)載體pUNCH682中切出PorB基因,構(gòu)建了PorB真核表達(dá)載體pcDNA3.1PorB,瞬時(shí)轉(zhuǎn)染COS-1細(xì)胞后,經(jīng)Western-blotting驗(yàn)證,該重組載體可以在COS-1細(xì)胞中表達(dá)PorB。大量提取pcDNA3.1PorB,4次基因免疫BALB/c小鼠后誘生的淋病奈瑟菌特異性抗體效價(jià)較低,僅為1:200。用原核表達(dá)的rPorB加強(qiáng)免疫一次后抗體水平可大幅度提高,可達(dá)1:3200以上。完全以PorB蛋白免疫小鼠能誘生出更高的特異性抗體水平。但是在免疫血清免疫保護(hù)性方面,兩種免疫方案獲得的血清均表現(xiàn)出良好的抗菌活性和調(diào)理吞噬作用;完全以PorB蛋白免疫的小鼠血清免疫保護(hù)作用略低。 為了研究NspA和PorB的免疫保護(hù)作用是否具有協(xié)同性,將二者進(jìn)行聯(lián)合免疫。實(shí)驗(yàn)小鼠分為2組,一是rNspA和rPorB蛋白免疫組,二是先以基因免疫然后用重組蛋白加強(qiáng)組。每組小鼠接種的免疫原總含量不變,其中兩種免疫原各占一半。ELISA檢測(cè)結(jié)果表明蛋白免疫獲得的血清IgG水平略高,但兩種免疫方案均產(chǎn)生了較高水平的血清IgG,且兩種抗原聯(lián)合免疫后的血清IgG的水平比原來(lái)單個(gè)抗原免疫的血清IgG水平要高出許多;抗體介導(dǎo)的補(bǔ)體溶菌實(shí)驗(yàn)和調(diào)理吞噬實(shí)驗(yàn)結(jié)果均表明,聯(lián)合免疫血清的淋病奈瑟菌特異性抗菌活性高于單一抗原免疫血清。提示兩種抗原之間確實(shí)存在一定的協(xié)同作用。此外,先基因免疫后蛋白加強(qiáng)組小鼠血清的保護(hù)作用仍強(qiáng)于蛋白免疫組血清,表明該免疫方案具有一定的優(yōu)越性。
[Abstract]:Gonorrhoea is a common sexually transmitted disease ( STD ) , which is caused by Neisseria Gonorrhoea infection , which mainly causes acute urinary tract inflammation , prostatitis and accessory orchitis in men . In women , it is mainly manifested as recessive infection , which can lead to infection of pelvic inflammatory disease , endometritis and salpingitis , which can lead to infertility . The incidence of gonococcal disease is high , which is the focus of prevention and treatment of chronic diseases . As a result of the high degree of variation , the other important adhesion factor Opa protein is also limited in the development of gonococcus vaccine . The recombinant eukaryotic expression vector pCNspA has produced NspA specific antibody which has the effect of mediating complement dissolution of Neisseria . The recombinant eukaryotic expression vector pCNspA has a very important outer membrane protein , but the purified pore protein in the cells can contaminate the Rmp protein . The highly purified porin can stimulate the animal to produce protective antibody with high titer . The recombinant protein NspA . rNspA was immunized with rNspA . The results showed that pQE31NspA could express recombinant protein NspA . rNspA . In order to avoid the pollution of Rmp protein and improve the effect of gene immunization , the PorB gene was excised from the prokaryotic expression vector pUNCH682 of PorB prokaryotic expression vector from Dr . Christopher . In order to study whether the immune protective effects of NspA and PorB were synergistic , the two groups were combined . The experimental mice were divided into 2 groups , one was rNspA and rPorB protein immune group , and the two kinds of immunity were higher than that of single antigen . The results of ELISA showed that the serum IgG level was higher than that of single antigen .

【學(xué)位授予單位】：揚(yáng)州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號(hào)】：R759.2;R392

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1464813