發(fā)布時間：2018-01-25 07:51

  本文關(guān)鍵詞： 胚胎干細胞 胰島樣細胞 印記基因 表觀遺傳學(xué) 胚胎干細胞 印記基因 DNA甲基轉(zhuǎn)移酶 表觀遺傳學(xué) KvDMR1　出處：《中南大學(xué)》2010年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】： 目的 體外誘導(dǎo)小鼠胚胎干細胞SF1-G定向誘導(dǎo)分化為胰島樣細胞,觀察誘導(dǎo)分化培養(yǎng)過程中印記基因Kcnq1、Cdknlc印記變化,探討胚胎干細胞體外誘導(dǎo)分化培養(yǎng)過程中表觀遺傳學(xué)的穩(wěn)定性。 方法 1.從孕小鼠胚胎分離培養(yǎng)小鼠胚胎成纖維細胞,絲裂霉素C處理第3-5代小鼠胚胎成纖維細胞制備飼養(yǎng)層細胞,在飼養(yǎng)層細胞上擴增培養(yǎng)小鼠胚胎干細胞株SF1-G細胞。 2.參照Shi等人的三階段法,定向誘導(dǎo)小鼠胚胎干細胞SF1-G向胰島樣細胞分化；細胞免疫熒光染色和RT-PCR檢測分化細胞中胰島細胞特異性標(biāo)志物的表達。 3.在誘導(dǎo)分化培養(yǎng)的不同階段收集細胞,逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)／限制性內(nèi)切酶片段長度多態(tài)性(RT-PCR/RFLP)檢測印記基因Kcnq1、Cdknlc表達的親本來源,分析其印記狀態(tài)。 結(jié)果 1.SF1-G細胞能在飼養(yǎng)層細胞上保持未分化狀態(tài)增殖培養(yǎng)。 2.RT-PCR結(jié)果顯示,在誘導(dǎo)分化的第三階段,細胞逐漸出現(xiàn)胰島細胞特異性基因的表達；細胞免疫熒光結(jié)果顯示,分化終末細胞可表達胰島細胞特異性激素蛋白,證實成功將胚胎干細胞誘導(dǎo)分化為胰島樣細胞。 3.RT-PCR/RFLP分析結(jié)果顯示,誘導(dǎo)分化后的細胞印記基因Kcnq1、Cdknlc從母源單等位基因表達轉(zhuǎn)變成雙等位基因表達,出現(xiàn)印記丟失(LOI),而持續(xù)傳代培養(yǎng)的ES細胞中Kcnq1、Cdknlc仍表現(xiàn)為母源單等位基因表達,即印記保持(MOI)。 結(jié)論 1.參照Shi等人的方法,我們能將小鼠胚胎干細胞體外定向誘導(dǎo)培養(yǎng)分化為胰島樣細胞。 2.是誘導(dǎo)分化培養(yǎng)作用,而不是單純的細胞傳代培養(yǎng)過程導(dǎo)致印記基因表達異常,出現(xiàn)印記丟失,即細胞誘導(dǎo)分化培養(yǎng)過程導(dǎo)致了表觀遺傳性狀的不穩(wěn)定。 目的 觀察胚胎干細胞SF1-G在誘導(dǎo)分化前后印記基因Kcnq1、Cdknlc印記調(diào)控區(qū)(ICR)差異性DNA甲基化區(qū)KvDMR1的甲基化狀態(tài),以及分化各階段細胞中DNA甲基轉(zhuǎn)移酶水平變化,以探討胚胎干細胞在體外誘導(dǎo)分化培養(yǎng)過程中印記基因Kcnq1、Cdknlc表達變化的機理。 方法 1.重亞硫酸鹽PCR測序法檢測分化前后Kcnq1、Cdknlc基因印記調(diào)控區(qū)KvDMR1的CpG位點甲基化狀態(tài)：1)收集未分化的細胞及誘導(dǎo)分化終末的細胞,提取基因組DNA,重亞硫酸鹽處理DNA,以特異性引物PCR擴增差異性DNA甲基化區(qū)KvDMR1;2)將PCR產(chǎn)物連接到氨芐抗性T載體質(zhì)粒后轉(zhuǎn)入感受態(tài)細菌,用不含氨芐的LB培養(yǎng)基搖菌后均勻涂在氨芐瓊脂糖平板上,次日挑取陽性細菌克隆,用含氨芐的LB培養(yǎng)基篩選陽性細菌；3)PCR驗證細菌中存在目的片段后,將菌液送送上海生工生物工程公司測序,測序結(jié)果通過軟件進行分析,了解分化前后細胞的KvDMR1的甲基化狀態(tài)。 2. Western blot檢測誘導(dǎo)分化各階段細胞中DNA甲基轉(zhuǎn)移酶Dmnt1和Dmnt3b的表達水平。 結(jié)果 1.測序檢測了KvDMR1區(qū)23個CpG位點的甲基化狀態(tài),在分化前的胚胎干細胞中,9個測序結(jié)果顯示,有4個表現(xiàn)為1-23個CpG位點全部甲基化,另外5個表現(xiàn)為所有CpG位點都未甲基化,即KvDMR1區(qū)的CpG位點表現(xiàn)為全甲基化或全未甲基化,符合印記調(diào)控區(qū)域差異性DNA甲基化區(qū)(DMR)的特點；而在分化后的細胞中,11個測序結(jié)果顯示,其中5個表現(xiàn)為1-23個CpG位點全部甲基化,4個在第18-23個CpG位點發(fā)生甲基化,而其余CpG位點未甲基化,其余2個表現(xiàn)為所有CpG位點都未甲基化,提示原來未甲基化的KvDMR1發(fā)生了甲基化。 2. Western blot結(jié)果顯示,胚胎干細胞誘導(dǎo)分化后,從第二階段開始DNA甲基轉(zhuǎn)移酶Dmnt1水平顯著升高；DNA甲基轉(zhuǎn)移酶Dmnt3b在第三階段也顯著升高,而同期傳代培養(yǎng)的未分化細胞DNA甲基轉(zhuǎn)移酶水平?jīng)]有明顯變化。 結(jié)論 1.誘導(dǎo)分化過程中印記調(diào)控區(qū)域的差異性DNA甲基化區(qū)KvDMR1的第18-23個CpG位點甲基化狀態(tài)的改變可能與印記基因Kcnq1、Cdknlc的印記丟失相關(guān)。 2.誘導(dǎo)分化過程中DNA甲基轉(zhuǎn)移酶水平升高,可能介導(dǎo)了KvDMR1區(qū)甲基化狀態(tài)的改變,最終引起基因印記狀態(tài)發(fā)生改變,導(dǎo)致印記丟失。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：中南大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號】：R329

【參考文獻】

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本文編號：1462395