本文關(guān)鍵詞： 胚胎干細(xì)胞 胰島樣細(xì)胞 印記基因 表觀遺傳學(xué) 胚胎干細(xì)胞 印記基因 DNA甲基轉(zhuǎn)移酶 表觀遺傳學(xué) KvDMR1　出處：《中南大學(xué)》2010年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】： 目的 體外誘導(dǎo)小鼠胚胎干細(xì)胞SF1-G定向誘導(dǎo)分化為胰島樣細(xì)胞,觀察誘導(dǎo)分化培養(yǎng)過(guò)程中印記基因Kcnq1、Cdknlc印記變化,探討胚胎干細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化培養(yǎng)過(guò)程中表觀遺傳學(xué)的穩(wěn)定性。 方法 1.從孕小鼠胚胎分離培養(yǎng)小鼠胚胎成纖維細(xì)胞,絲裂霉素C處理第3-5代小鼠胚胎成纖維細(xì)胞制備飼養(yǎng)層細(xì)胞,在飼養(yǎng)層細(xì)胞上擴(kuò)增培養(yǎng)小鼠胚胎干細(xì)胞株SF1-G細(xì)胞。 2.參照Shi等人的三階段法,定向誘導(dǎo)小鼠胚胎干細(xì)胞SF1-G向胰島樣細(xì)胞分化；細(xì)胞免疫熒光染色和RT-PCR檢測(cè)分化細(xì)胞中胰島細(xì)胞特異性標(biāo)志物的表達(dá)。 3.在誘導(dǎo)分化培養(yǎng)的不同階段收集細(xì)胞,逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)／限制性內(nèi)切酶片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RT-PCR/RFLP)檢測(cè)印記基因Kcnq1、Cdknlc表達(dá)的親本來(lái)源,分析其印記狀態(tài)。 結(jié)果 1.SF1-G細(xì)胞能在飼養(yǎng)層細(xì)胞上保持未分化狀態(tài)增殖培養(yǎng)。 2.RT-PCR結(jié)果顯示,在誘導(dǎo)分化的第三階段,細(xì)胞逐漸出現(xiàn)胰島細(xì)胞特異性基因的表達(dá)；細(xì)胞免疫熒光結(jié)果顯示,分化終末細(xì)胞可表達(dá)胰島細(xì)胞特異性激素蛋白,證實(shí)成功將胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為胰島樣細(xì)胞。 3.RT-PCR/RFLP分析結(jié)果顯示,誘導(dǎo)分化后的細(xì)胞印記基因Kcnq1、Cdknlc從母源單等位基因表達(dá)轉(zhuǎn)變成雙等位基因表達(dá),出現(xiàn)印記丟失(LOI),而持續(xù)傳代培養(yǎng)的ES細(xì)胞中Kcnq1、Cdknlc仍表現(xiàn)為母源單等位基因表達(dá),即印記保持(MOI)。 結(jié)論 1.參照Shi等人的方法,我們能將小鼠胚胎干細(xì)胞體外定向誘導(dǎo)培養(yǎng)分化為胰島樣細(xì)胞。 2.是誘導(dǎo)分化培養(yǎng)作用,而不是單純的細(xì)胞傳代培養(yǎng)過(guò)程導(dǎo)致印記基因表達(dá)異常,出現(xiàn)印記丟失,即細(xì)胞誘導(dǎo)分化培養(yǎng)過(guò)程導(dǎo)致了表觀遺傳性狀的不穩(wěn)定。 目的 觀察胚胎干細(xì)胞SF1-G在誘導(dǎo)分化前后印記基因Kcnq1、Cdknlc印記調(diào)控區(qū)(ICR)差異性DNA甲基化區(qū)KvDMR1的甲基化狀態(tài),以及分化各階段細(xì)胞中DNA甲基轉(zhuǎn)移酶水平變化,以探討胚胎干細(xì)胞在體外誘導(dǎo)分化培養(yǎng)過(guò)程中印記基因Kcnq1、Cdknlc表達(dá)變化的機(jī)理。 方法 1.重亞硫酸鹽PCR測(cè)序法檢測(cè)分化前后Kcnq1、Cdknlc基因印記調(diào)控區(qū)KvDMR1的CpG位點(diǎn)甲基化狀態(tài)：1)收集未分化的細(xì)胞及誘導(dǎo)分化終末的細(xì)胞,提取基因組DNA,重亞硫酸鹽處理DNA,以特異性引物PCR擴(kuò)增差異性DNA甲基化區(qū)KvDMR1;2)將PCR產(chǎn)物連接到氨芐抗性T載體質(zhì)粒后轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)菌,用不含氨芐的LB培養(yǎng)基搖菌后均勻涂在氨芐瓊脂糖平板上,次日挑取陽(yáng)性細(xì)菌克隆,用含氨芐的LB培養(yǎng)基篩選陽(yáng)性細(xì)菌；3)PCR驗(yàn)證細(xì)菌中存在目的片段后,將菌液送送上海生工生物工程公司測(cè)序,測(cè)序結(jié)果通過(guò)軟件進(jìn)行分析,了解分化前后細(xì)胞的KvDMR1的甲基化狀態(tài)。 2. Western blot檢測(cè)誘導(dǎo)分化各階段細(xì)胞中DNA甲基轉(zhuǎn)移酶Dmnt1和Dmnt3b的表達(dá)水平。 結(jié)果 1.測(cè)序檢測(cè)了KvDMR1區(qū)23個(gè)CpG位點(diǎn)的甲基化狀態(tài),在分化前的胚胎干細(xì)胞中,9個(gè)測(cè)序結(jié)果顯示,有4個(gè)表現(xiàn)為1-23個(gè)CpG位點(diǎn)全部甲基化,另外5個(gè)表現(xiàn)為所有CpG位點(diǎn)都未甲基化,即KvDMR1區(qū)的CpG位點(diǎn)表現(xiàn)為全甲基化或全未甲基化,符合印記調(diào)控區(qū)域差異性DNA甲基化區(qū)(DMR)的特點(diǎn)；而在分化后的細(xì)胞中,11個(gè)測(cè)序結(jié)果顯示,其中5個(gè)表現(xiàn)為1-23個(gè)CpG位點(diǎn)全部甲基化,4個(gè)在第18-23個(gè)CpG位點(diǎn)發(fā)生甲基化,而其余CpG位點(diǎn)未甲基化,其余2個(gè)表現(xiàn)為所有CpG位點(diǎn)都未甲基化,提示原來(lái)未甲基化的KvDMR1發(fā)生了甲基化。 2. Western blot結(jié)果顯示,胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)分化后,從第二階段開(kāi)始DNA甲基轉(zhuǎn)移酶Dmnt1水平顯著升高；DNA甲基轉(zhuǎn)移酶Dmnt3b在第三階段也顯著升高,而同期傳代培養(yǎng)的未分化細(xì)胞DNA甲基轉(zhuǎn)移酶水平?jīng)]有明顯變化。 結(jié)論 1.誘導(dǎo)分化過(guò)程中印記調(diào)控區(qū)域的差異性DNA甲基化區(qū)KvDMR1的第18-23個(gè)CpG位點(diǎn)甲基化狀態(tài)的改變可能與印記基因Kcnq1、Cdknlc的印記丟失相關(guān)。 2.誘導(dǎo)分化過(guò)程中DNA甲基轉(zhuǎn)移酶水平升高,可能介導(dǎo)了KvDMR1區(qū)甲基化狀態(tài)的改變,最終引起基因印記狀態(tài)發(fā)生改變,導(dǎo)致印記丟失。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：中南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號(hào)】：R329

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1462395