本文關(guān)鍵詞： 調(diào)節(jié)性T細胞(T-reg) 免疫熒光 激光共聚焦顯微鏡 MHC鏈相關(guān)基因A(MICA) 轉(zhuǎn)化生長因子β1 熒光定量PCR　出處：《福建醫(yī)科大學(xué)》2008年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】： 【目的】分析T-reg細胞在乳腺癌病人中的表達情況及其與NK細胞、T細胞亞群之間的關(guān)系;探討體外富集的T-reg對NK細胞殺傷乳腺癌細胞的影響;探討NKG2D-MICA在NK細胞殺傷乳腺癌中的作用;觀察T-reg對NKG2D-MICA作用的影響。 【方法】1、流式細胞術(shù)檢測乳腺癌患者外周血T-reg的比例;探討乳腺癌患者TGF-β1的變化。2、應(yīng)用LDH法檢測NK細胞對四種乳腺癌細胞株殺傷率活性。3、ELISA檢測培養(yǎng)上清液中IFN-γ和TGF-β1的水平4、熒光定量PCR檢測四種乳腺癌細胞株MICA-mRNA的表達。5、應(yīng)用流式細胞術(shù)檢測四種乳腺癌細胞株表面及胞內(nèi)MICA的表達;6、應(yīng)用免疫組化技術(shù)和免疫熒光技術(shù)檢測四種乳腺癌細胞株MICA的分布情況。7、應(yīng)用FCM檢測NK細胞表面的NKG2D的變化。 【結(jié)果】1、乳腺癌病人T-reg的表達:乳腺癌病人和健康志愿者外周血中T-reg占CD4+T細胞總數(shù)的百分比分別是(7.5±3.0)%和(5.1±1.5)%,前者高于后者(P0.01)。2、當(dāng)NK細胞與乳腺癌細胞效靶比為10:1時,對MCF-7、MDA-MB-435s、SKBr-3和MDA-MB-231的殺傷活性分別為(40.7±3.0)%、(15.5±3.1)%、(29.7±1.8)%以及59.1±2.3)%;加入T-reg的數(shù)量為1/5的NK細胞時,殺傷活性分別降至(1.9±0.2)%、(5.7±0.4)%、(3.6±2.8)%以及(3.9±0.2)%;加入T-reg的數(shù)量為1/10的NK細胞時,殺傷活性分別降至(7.6±1.6)%、(7.3±1.0)%、(6.6±2.5)%以及(19.7±1.1)%。3、ELISA檢測NK細胞分泌的IFN-γ結(jié)果顯示:在無T-reg存在時,NK細胞與MCF-7、MDA-MB-435s、SKBr-3和MDA-MB-231共培養(yǎng)時IFN-γ濃度分別為(221.5±2.6)pg/ml、(264.4±5.5)pg/ml、(754.6±19.0)pg/ml以及(423.0±14.6)pg/ml;加入T-reg的數(shù)量為1/5的NK細胞時,IFN-γ濃度分別為(70.7±8.5)pg/ml、(14.6±0.9)pg/ml、(128.3±4.0)pg/ml以及(6.0±1.0)pg/ml;加入T-reg的數(shù)量為1/10的NK細胞時,IFN-γ濃度分別為(216.6±4.8)pg/ml、(251.7±2.2)pg/ml、(535.0±8.5)pg/ml以及(52.57±3.4)pg/ml。4、ELISA檢測培養(yǎng)上清液中T-reg分泌的TGF-β1結(jié)果顯示:在無T-reg存在時,NK細胞與MCF-7、MDA-MB-435s、SKBr-3和MDA-MB-231共培養(yǎng)時TGF-β1濃度分別為(13.4±0.2)pg/ml、(11.3±0.8)pg/ml、(62.9±1.3)pg/ml以及(6.2±0.5)pg/ml;加入T-reg的數(shù)量為1/5的NK細胞時,TGF-β1濃度分別為(27.2±0.3)ng/ml、(12.2±1.0)ng/ml、(77.6±1.0)ng/ml以及(9.1±0.1)ng/ml;加入T-reg的數(shù)量為1/10的NK細胞時,TGF-β1濃度分別為(46.8±1.6)ng/ml、(15.8±0.9)ng/ml、(87.8±2.3)ng/ml以及(10.9±0.6)ng/ml。5、MICA的表達與分布:(1)熒光定量PCR結(jié)果顯示:MDA-MB-231、SKBr-3、MCF-7和MDA-MB-435s四種細胞株MICAmRNA相對于GAPDH的相對含量分別為5.56×10-3、2.53×10-3、1.68×10-3和5.99×10-5。(2)流式細胞術(shù)檢測4種乳腺癌細胞株MICA表達,結(jié)果顯示MDA-MB-231表達量為(61.5±4.5)%、MCF-7為(56.5±4.7)%,而SKBr-3和MDA-MB-435s幾乎不表達MICA分子;穿孔后MDA-MB-231和MCF-7這兩株細胞株MICA的表達量與穿孔前相比增加不明顯,而MDA-MB-435s和SKBr-3這兩株細胞株MICA的表達量分別為(26.4±2.5)%和(20.7±1.3)%。(3)免疫組化證實MDA-MB-231細胞和SKBr-3細胞MICA在細胞膜和細胞漿都有表達,MCF-7細胞MICA在細胞漿和核膜都有表達,MDA-MB-435s細胞MICA主要在細胞漿表達;免疫熒光證實MDA-MB-231細胞和SKBr-3細胞MICA在細胞膜和細胞漿都有表達,MCF-7細胞MICA主要表達在細胞膜上,MDA-MB-435s細胞MICA主要在細胞漿表達。NK對不同的乳腺癌細胞株的殺傷結(jié)果表明,乳腺癌細胞株MICA表達部位不同,NK細胞對其殺傷率不同。 【結(jié)論】T-reg細胞對NK細胞殺傷乳腺癌的作用其機制可能與T-reg分泌的細胞因子TGF-β1有關(guān)。MICA在乳腺癌細胞膜上表達越多,NK細胞對該細胞的殺傷率越高。
[Abstract]:Objective To investigate the expression of T - reg cells in breast cancer patients and their relationship with NK cells and T cell subsets , and to investigate the effect of T - reg on NK cells killing breast cancer cells , and to investigate the effect of NKG2D - MICA on NK cells killing breast cancer . Methods : The proportion of peripheral blood T - reg in patients with breast cancer was detected by flow cytometry . The expression of TGF - 尾1 in breast cancer patients was investigated . The expression of MICA - mRNA in four breast cancer cell lines was detected by using LDH method . The distribution of MICA in four breast cancer cell lines was detected by flow cytometry . The percentage of T - reg in peripheral blood of breast cancer patients and healthy volunteers was ( 70.5 鹵 3.0 ) % and ( 5.1 鹵 1 . 5 ) % , respectively . When NK cells with T - reg was 1 / 5 , the cytotoxicity of NK cells was ( 70.7 鹵 8.6 ) % , ( 74.6 鹵 0.9 ) pg / ml , ( 64.0 鹵 1.0 ) pg / ml and ( 6.0 鹵 1.0 ) pg / ml , respectively . The results showed that the concentrations of TGF - 尾1 and MDA - MB - 231 , SKBr - 3 , MCF - 7 and MDA - MB - 435 were ( 62.8 鹵 0.3 ) ng / ml , ( 62.9 鹵 0.3 ) ng / ml and ( 9.1 鹵 0.1 ) ng / ml , respectively . ( 3 ) The expression of MICA of MDA - MB - 231 cells and SKBr - 3 cells was confirmed by immunohistochemistry . The MICA of MCF - 7 cells was expressed in plasma and nuclear membrane . The MICA of MDA - MB - 231 cells and SKBr - 3 cells were mainly expressed in cell membranes and cytoplasm . The results showed that MICA of MDA - MB - 231 cells and SKBr - 3 cells were mainly expressed in cell membranes and cytoplasm . Conclusion The mechanism of killer T - reg cells on killing breast cancer by NK cells may be related to the cytokine TGF - 尾1 secreted by T - reg . The higher the expression of MICA on the cell membrane of breast cancer , the higher the killing rate of NK cells on the cells .

【學(xué)位授予單位】：福建醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號】：R392.12;R737.9

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本文編號：1457243