本文關(guān)鍵詞： 雙歧桿菌 完整肽聚糖 工業(yè)化提取工藝 抑瘤機理　出處：《內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)》2009年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】： 本課題研究了嬰兒雙歧桿菌(Bifidobacterium infantis 6069)完整肽聚糖在工業(yè)化生產(chǎn)條件下的提取工藝,并對提取的完整肽聚糖進行了質(zhì)量及其抗腫瘤作用機理的研究,為其推廣應(yīng)用提供了必要的理論依據(jù)。 采用發(fā)酵工程研究方法,對嬰兒雙歧桿菌菌株的適宜培養(yǎng)溫度、適宜培養(yǎng)基、培養(yǎng)終點、離心條件、冷凍干燥保護劑進行了研究,確定了改良的TPY培養(yǎng)基,嬰兒雙歧桿菌菌株經(jīng)培養(yǎng)后發(fā)酵液活菌數(shù)可達5×109cfu/mL,凍干菌粉活菌數(shù)可達2.8×1011～3.0×1011cfu/g,其增菌效果高于高密度發(fā)酵法。 根據(jù)革蘭氏陽性菌細胞壁結(jié)構(gòu)可知磷壁酸與細胞壁通透性有很大的關(guān)系,因此,首先抽提磷壁酸使細胞膜通透性增加,有利于外界物質(zhì)更好的作用于細胞和細胞內(nèi)容物質(zhì)更容易排出,然后脫掉胞膜上的脂肪類物質(zhì),最后用復(fù)合酶酶解細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)類物質(zhì)。通過試驗確定完整肽聚糖提取工藝路線為:10%TCA在70℃攪拌1hr;用乙酸鈉、氯仿、甲醇混合液脫脂24hrs;用濃度為2000U的胰酶和堿性蛋白酶共同處理12hrs,最后通過離心清洗去除雜質(zhì)。針對改良法和Sekine法所提取的完整肽聚糖做了全面的結(jié)構(gòu)和成分分析,結(jié)果表明,采用改良法所提取的完整肽聚糖其超微結(jié)構(gòu)完整,氨基己糖含量為20.04 mg/g;蛋白質(zhì)含量為339.6 mg/g;中性糖含量為500.01 mg/g;總脂含量為36.84 mg/g;磷含量為0.3 mg/g。實驗證明,與傳統(tǒng)Sekine法相比,改良法所獲得完整肽聚糖不僅品質(zhì)沒有劣化,還縮短了提取時間并節(jié)約了成本。 本試驗通過測定脾臟指數(shù)、觀察ConA促進脾淋巴細胞增殖作用、脾臟巨噬細胞吞噬中性紅的能力、檢測血清中IFN-γ、IL-12、TNF-α的含量、計算腫瘤生長抑制率以及腫瘤細胞中癌基因Bcl-2和抑癌基因Bax蛋白的表達程度,從而發(fā)現(xiàn),嬰兒雙歧桿菌完整肽聚糖對試驗小鼠的細胞免疫可產(chǎn)生有利于機體免疫功能狀態(tài)的調(diào)節(jié)作用;對體外移植性小鼠肝癌H22腫瘤具有明顯的抑制生長作用,其抗腫瘤的機制可能是通過增強荷瘤小鼠的免疫功能、抑制腫瘤細胞增殖、誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡而發(fā)揮作用。
[Abstract]:The research of Bifidobacterium infantis (Bifidobacterium infantis 6069) whole peptidoglycan extraction process in the industrial production conditions, and the extraction of whole peptidoglycan of quality and its antitumor mechanism, provide necessary theoretical basis for its application.
Using the research methods of fermentation engineering, the suitable culture temperature on infant Bifidobacterium strains, suitable medium, culture conditions of centrifugal, end point, freeze drying protective agent was studied, the improved TPY medium, Bifidobacterium infantis strains cultured in fermentation broth of viable count was 5 * 109cfu/mL, live freeze-dried powder. The number of bacteria is 2.8 * 1011 ~ 3 * 1011cfu/g, the enrichment effect is higher than that of high density fermentation.
According to the structure of the cell wall of gram positive bacteria that teichoic acid and cell wall permeability have a great relationship, therefore, the first extraction of teichoic acid makes the cell membrane permeability increased, is conducive to a better role in the outside cell and content more easily discharged, and take off the fat cell membrane proteins, the final solution materials in the cell by enzymatic. Through the test to determine the whole peptidoglycan extraction process route is: 10%TCA at 70 DEG C, stirring 1hr; using sodium acetate, chloroform, methanol mixture extract 24hrs; concentration of 2000U trypsin and alkaline protease treatment 12hrs, finally through the centrifugal cleaning to remove impurities. Whole peptidoglycan extracted for the improved method and Sekine method to do the analysis of the structure and composition of the comprehensive results show that the improved method of whole peptidoglycan extracted the ultrastructure of hexosamine content of 20.04 mg /g; protein content is 339.6 mg/g; neutral sugar content is 500.01 mg/g; total lipid content is 36.84 mg/g; phosphorus content is 0.3 mg/g.. Experiments show that compared with traditional Sekine method, the improved PPG not only has no deterioration in quality, but also shortens the extraction time and saves costs.
This experiment by measuring the spleen index, observe the promoting effect of ConA lymphocyte proliferation, phagocytosis of macrophages in the spleen, serum IFN- gamma, IL-12, content of TNF- alpha, calculate the inhibition rate of tumor growth and tumor cells in cancer gene Bcl-2 and tumor suppressor gene Bax protein expression level, and found the baby cell immunity whole peptidoglycan of Bifidobacterium in mice can produce beneficial immune function regulation; has an obvious effect on inhibiting the growth of in vitro transplanted hepatoma H22 tumor, the anti-tumor mechanism may be through enhancing the immune function of tumor bearing mice, inhibit tumor cell proliferation and induce the apoptosis of tumor cells and play a role.

【學(xué)位授予單位】：內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號】：R371;TQ464

【參考文獻】

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本文編號：1449342