本文關鍵詞： B型流感病毒 雜交瘤 抗體 cDNA文庫 生物信息學 EST　出處：《第三軍醫(yī)大學》2008年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】： 流行性感冒(influenza,簡稱流感)是由流行性感冒病毒引起的急性呼吸道傳染病,是人類面臨的主要公共健康問題之一。據(jù)統(tǒng)計,流感每年的發(fā)病率為10%～30%,其流行病學的特點是:突然暴發(fā),迅速蔓延,播及面廣。流感流行具有一定的季節(jié)性。我國北方常發(fā)生于冬季,而南方多發(fā)生在冬夏兩季。流感發(fā)病率高,人群普遍易感。流感臨床癥狀較重,起病急驟,并發(fā)癥發(fā)生率高,特別是肺炎,可引起死亡,死者大多為年邁體弱和幼年多病或有慢性基礎病者。B型流感病毒近年來常造成流感局部區(qū)域性暴發(fā)。 病毒的感染過程其實就是病毒與宿主或機體相互斗爭的過程。雜交瘤細胞是一種“1+12”的特殊細胞,其分泌抗體的基因源于受到免疫原刺激的宿主免疫細胞  B細胞。她的基因組承載著病原體與宿主相互作用的信息,同時由于整合了腫瘤細胞的“長生基因”,使其成活時間明顯延長,而且極有可能產(chǎn)生一些基因的突變和重組,并由此產(chǎn)生一些抗體之外的新物質(zhì)。因此流感病毒B單抗雜交瘤細胞基因組的研究是一個值得探索的課題。如何迅速、高效的從基因組中獲取生物學信息,是一個富有挑戰(zhàn)性的課題,EST技術(shù)就是基于這種認識而發(fā)展起來的。 本試驗用純化的Flu B抗原免疫小鼠,擬制備能穩(wěn)定分泌特異性單克隆抗體的雜交瘤細胞株,為研制一種方便、快捷、特異的金標試紙快速診斷方法打下堅實的基礎,同時擬構(gòu)建分泌抗Flu B抗體雜交瘤細胞cDNA文庫并測序,獲取EST片斷,再通過美國國家生物信息中心(National Center Biotechnology Information, NCBI)服務器的UniGene數(shù)據(jù)庫進行BLAST檢索,應用sequencher軟件對EST序列進行片斷重疊群分析,應用生物信息學方法研究雜交瘤基因,為預測和進一步開發(fā)雜交瘤細胞的功能提供理論基礎。 方法和結(jié)果: 1.應用純化的B型流感病毒抗原免疫BALB/c小鼠,經(jīng)過5次免疫、細胞融合、融合細胞的亞克隆,獲得了3株能穩(wěn)定分泌抗B型流感病毒單克隆抗體的雜交瘤細胞,分別命名為:3B2,12G3,5A4。3株雜交瘤細胞株染色體計數(shù)檢測顯示接近親本細胞染色體數(shù)目之和。3株單抗的重鏈均為IgG1型,輕鏈為κ鏈,單抗效價較高、與A型流感病毒和RSV均不發(fā)生交叉反應。 2.應用經(jīng)典cDNA文庫構(gòu)建方法,經(jīng)過細胞總RNA的提取、mRNA的分離,以帶有多聚腺苷酸的mRNA為模板,反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈,第二鏈,cDNA雙鏈和載體的連接,轉(zhuǎn)入受體菌,構(gòu)建成雜交瘤細胞的cDNA文庫。該文庫庫容為1.27×106。 3.原始文庫中挑選了400個克隆,測序共得到384個序列,測序成功率為96%,將序列編輯后去除載體序列后得到長度在200bp～700bp的有效序列320條。經(jīng)過BLAST程序?qū)λ@得的EST片斷進行基因,結(jié)果顯示有118條序列與數(shù)據(jù)庫中的已知基因有較好的相似性。經(jīng)過Sequencher 4.8軟件將384條EST片斷的進行片斷重疊群(contig)分析,結(jié)果共得到包括71條EST序列在內(nèi)的25組片斷重疊群,占全部EST序列的22.2%,其余249條都屬于單拷貝序列。 結(jié)論: 1.成功制備抗B型流感病毒雜交瘤細胞株,為金標法快速診斷B型流感病毒感染奠定了基礎。 2.抗B型流感病毒雜交瘤細胞cDNA文庫的成功構(gòu)建和部分克隆的測序,對于新基因的克隆和功能研究提供了可用資源,同時對預測和進一步開發(fā)雜交瘤細胞的功能提供了良好的物質(zhì)基礎。 3.為建立雜交瘤細胞的資源信息庫做了重要的開端工作。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：第三軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2008
【分類號】：R346

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本文編號：1448103