發(fā)布時(shí)間：2018-01-20 11:57

  本文關(guān)鍵詞： B型流感病毒 雜交瘤 抗體 cDNA文庫(kù) 生物信息學(xué) EST　出處：《第三軍醫(yī)大學(xué)》2008年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】： 流行性感冒(influenza,簡(jiǎn)稱流感)是由流行性感冒病毒引起的急性呼吸道傳染病,是人類面臨的主要公共健康問(wèn)題之一。據(jù)統(tǒng)計(jì),流感每年的發(fā)病率為10%～30%,其流行病學(xué)的特點(diǎn)是:突然暴發(fā),迅速蔓延,播及面廣。流感流行具有一定的季節(jié)性。我國(guó)北方常發(fā)生于冬季,而南方多發(fā)生在冬夏兩季。流感發(fā)病率高,人群普遍易感。流感臨床癥狀較重,起病急驟,并發(fā)癥發(fā)生率高,特別是肺炎,可引起死亡,死者大多為年邁體弱和幼年多病或有慢性基礎(chǔ)病者。B型流感病毒近年來(lái)常造成流感局部區(qū)域性暴發(fā)。 病毒的感染過(guò)程其實(shí)就是病毒與宿主或機(jī)體相互斗爭(zhēng)的過(guò)程。雜交瘤細(xì)胞是一種“1+12”的特殊細(xì)胞,其分泌抗體的基因源于受到免疫原刺激的宿主免疫細(xì)胞  B細(xì)胞。她的基因組承載著病原體與宿主相互作用的信息,同時(shí)由于整合了腫瘤細(xì)胞的“長(zhǎng)生基因”,使其成活時(shí)間明顯延長(zhǎng),而且極有可能產(chǎn)生一些基因的突變和重組,并由此產(chǎn)生一些抗體之外的新物質(zhì)。因此流感病毒B單抗雜交瘤細(xì)胞基因組的研究是一個(gè)值得探索的課題。如何迅速、高效的從基因組中獲取生物學(xué)信息,是一個(gè)富有挑戰(zhàn)性的課題,EST技術(shù)就是基于這種認(rèn)識(shí)而發(fā)展起來(lái)的。 本試驗(yàn)用純化的Flu B抗原免疫小鼠,擬制備能穩(wěn)定分泌特異性單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株,為研制一種方便、快捷、特異的金標(biāo)試紙快速診斷方法打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ),同時(shí)擬構(gòu)建分泌抗Flu B抗體雜交瘤細(xì)胞cDNA文庫(kù)并測(cè)序,獲取EST片斷,再通過(guò)美國(guó)國(guó)家生物信息中心(National Center Biotechnology Information, NCBI)服務(wù)器的UniGene數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST檢索,應(yīng)用sequencher軟件對(duì)EST序列進(jìn)行片斷重疊群分析,應(yīng)用生物信息學(xué)方法研究雜交瘤基因,為預(yù)測(cè)和進(jìn)一步開(kāi)發(fā)雜交瘤細(xì)胞的功能提供理論基礎(chǔ)。 方法和結(jié)果: 1.應(yīng)用純化的B型流感病毒抗原免疫BALB/c小鼠,經(jīng)過(guò)5次免疫、細(xì)胞融合、融合細(xì)胞的亞克隆,獲得了3株能穩(wěn)定分泌抗B型流感病毒單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞,分別命名為:3B2,12G3,5A4。3株雜交瘤細(xì)胞株染色體計(jì)數(shù)檢測(cè)顯示接近親本細(xì)胞染色體數(shù)目之和。3株單抗的重鏈均為IgG1型,輕鏈為κ鏈,單抗效價(jià)較高、與A型流感病毒和RSV均不發(fā)生交叉反應(yīng)。 2.應(yīng)用經(jīng)典cDNA文庫(kù)構(gòu)建方法,經(jīng)過(guò)細(xì)胞總RNA的提取、mRNA的分離,以帶有多聚腺苷酸的mRNA為模板,反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈,第二鏈,cDNA雙鏈和載體的連接,轉(zhuǎn)入受體菌,構(gòu)建成雜交瘤細(xì)胞的cDNA文庫(kù)。該文庫(kù)庫(kù)容為1.27×106。 3.原始文庫(kù)中挑選了400個(gè)克隆,測(cè)序共得到384個(gè)序列,測(cè)序成功率為96%,將序列編輯后去除載體序列后得到長(zhǎng)度在200bp～700bp的有效序列320條。經(jīng)過(guò)BLAST程序?qū)λ@得的EST片斷進(jìn)行基因,結(jié)果顯示有118條序列與數(shù)據(jù)庫(kù)中的已知基因有較好的相似性。經(jīng)過(guò)Sequencher 4.8軟件將384條EST片斷的進(jìn)行片斷重疊群(contig)分析,結(jié)果共得到包括71條EST序列在內(nèi)的25組片斷重疊群,占全部EST序列的22.2%,其余249條都屬于單拷貝序列。 結(jié)論: 1.成功制備抗B型流感病毒雜交瘤細(xì)胞株,為金標(biāo)法快速診斷B型流感病毒感染奠定了基礎(chǔ)。 2.抗B型流感病毒雜交瘤細(xì)胞cDNA文庫(kù)的成功構(gòu)建和部分克隆的測(cè)序,對(duì)于新基因的克隆和功能研究提供了可用資源,同時(shí)對(duì)預(yù)測(cè)和進(jìn)一步開(kāi)發(fā)雜交瘤細(xì)胞的功能提供了良好的物質(zhì)基礎(chǔ)。 3.為建立雜交瘤細(xì)胞的資源信息庫(kù)做了重要的開(kāi)端工作。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號(hào)】：R346

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