本文關(guān)鍵詞： 結(jié)核分枝桿菌 治療性疫苗 亞單位疫苗 Rv2007c Rv2626c 潛伏感染 動物模型　出處：《蘭州大學(xué)》2014年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：目的：全世界有三分之一的人群感染了結(jié)核分枝桿菌,其中有90%的人群處于潛伏感染狀態(tài),5%～10%的潛伏感染者未來會發(fā)展成為活動性結(jié)核,潛伏期的結(jié)核分枝桿菌的再活化與復(fù)發(fā)成為近年來結(jié)核病暴發(fā)的重要組成,而當(dāng)前廣泛使用的結(jié)核疫苗BCG不能殺死處于潛伏期的結(jié)核分枝桿菌,無法有效地預(yù)防潛伏狀態(tài)結(jié)核分枝桿菌的活化。本研究的主要目的有：(1)篩選結(jié)核分枝桿菌在潛伏狀態(tài)下高表達(dá)的抗原。(2)以結(jié)核潛伏期抗原為基礎(chǔ)構(gòu)建針對潛伏期結(jié)核分枝桿菌的融合蛋白亞單位疫苗。(3)建立易于操作的、安全的、與肺結(jié)核的發(fā)病機(jī)制相似的家兔肺部卡介苗(BCG)潛伏感染模型。(4)利用家兔肺部卡介苗潛伏感染模型評價(jià)多個(gè)結(jié)核亞單位疫苗的治療作用。該研究對于探討如何構(gòu)建潛伏性結(jié)核的治療性疫苗有重要的參考價(jià)值。 方法：(1)通過文獻(xiàn)資料的搜集、整理與分析,找到結(jié)核分枝桿菌在不同潛伏模型(不可培養(yǎng)模型、休眠調(diào)控子模型、巨噬細(xì)胞模型、不可復(fù)制模型、生長曲線改變模型、營養(yǎng)缺陷模型和人造肉芽腫模型)中高表達(dá)的基因258個(gè),經(jīng)過篩選得到有較強(qiáng)免疫原性的在多個(gè)結(jié)核潛伏模型中都有高表達(dá)的抗原基因,包括Rv2031c (HspX), Rv2626c (Hrp1), Rv2007c (FdxA), Rv1738和Rv1733c。(2)根據(jù)GeneBank數(shù)據(jù)庫中的各個(gè)基因的信息,設(shè)計(jì)特異性引物,以結(jié)核分枝桿菌H37Ra菌株的全基因組DNA為模板,PCR擴(kuò)增出FdxA和Hrpl兩個(gè)目的基因,將目的基因逐個(gè)依次連接在載體質(zhì)粒pET30a上,構(gòu)建重組質(zhì)粒pET30a-FdxA-Hrp1,將該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌表達(dá)菌株BL21中大量表達(dá)融合蛋白FdxA-Hrp1(F6)。用鎳離子金屬鰲合(Ni-NTA)親和層析的方法純化帶有His標(biāo)簽的融合蛋白F6。(3)用牛分枝桿菌減毒株卡介苗(BCG)和結(jié)核分枝桿菌無毒株H37Ra菌株通過氣管感染家兔肺部,感染后第十二周肌肉注射地塞米松降低家兔的免疫力,用量是0.5mg/kg,每天一次。連續(xù)干預(yù)5周后使用深度麻醉的方法使家兔安樂死,解剖家兔,進(jìn)行肺部結(jié)核菌落計(jì)數(shù)及肺部組織病理切片觀察與分析,根據(jù)兩種分枝桿菌在地塞米松干預(yù)后的暴發(fā)情況選擇合適的建模菌株。我們發(fā)現(xiàn)BCG做為感染菌株建立家兔肺部潛伏感染模型,在免疫抑制干預(yù)后可以有大量的BCG復(fù)活,并有特征性病理改變,故采用BCG建立家兔肺部潛伏感染模型。(4)利用建立的家兔肺部卡介苗潛伏感染模型評價(jià)融合蛋白疫苗的治療作用,使用的融合蛋白疫苗包括：重組了結(jié)核潛伏期抗原基因Rv2031c、Rv1738、Rv1733c的融合蛋白HspX-Rv1738-Rv1733c (H83)重組了結(jié)核潛伏期抗原基因Rv2007c、Rv2626c的融合蛋白疫苗FdxA-Hrp1(F6),和重組了結(jié)核生長期抗原基因ESAT6、Ag85B、Mtb8.4的融合蛋白ESAT6-Ag85B-MPT64190-198-Mtb8.4(EAMM),我們實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)證實(shí)EAMM對感染結(jié)核菌的小鼠具有較強(qiáng)免疫保護(hù)力。家兔肺部感染結(jié)核菌后應(yīng)用隨機(jī)數(shù)字表對實(shí)驗(yàn)家兔進(jìn)行完全隨機(jī)分組：BCG+生理鹽水(BCG組),BCG+佐劑(佐劑組)；BCG+(F6+H83)(F6+H83組)；BCG+EAMM (EAMM組)；BCG+EAMM+(F6+H83)(EAMM+F6+H83組),共計(jì)五組。疫苗組家兔分別于第5周、第7周、第9周在家兔左前臂用皮下注射的方法進(jìn)行疫苗治療干預(yù),生理鹽水組和佐劑組家兔在左前臂皮下注射生理鹽水和佐劑做對照。五組家兔從第11周開始連續(xù)通過肌肉注射地塞米松的方法免疫干預(yù)35天。第16周運(yùn)用深度麻醉的方法使家兔安樂死,進(jìn)行臟器分離與解剖,主要分離出家兔的胸腺、脾臟和肺臟,對各組家兔的肺部組織進(jìn)行蘇木精伊紅染色及抗酸染色觀察并進(jìn)行病理學(xué)分析,同時(shí)進(jìn)行結(jié)核結(jié)節(jié)計(jì)數(shù)及肺臟BCG菌落計(jì)數(shù)。 結(jié)果： 1.通過抗原篩選我們得到了5個(gè)潛伏期結(jié)核高表達(dá)的抗原基因Rv2031c、 Rv2626c、Rv2007c、Rvl738和Rv1733c。 2.以潛伏期結(jié)核抗原FdxA和Rv2626c為基礎(chǔ)構(gòu)建的融合蛋白F6在大腸桿菌中可溶性穩(wěn)定表達(dá),并且可以運(yùn)用鎳離子層析柱得到較高純度的蛋白。 3.成功建立了家兔肺部卡介苗潛伏感染模型,通過氣管感染途徑使家兔肺臟感染卡介苗BCG,4周后從家兔肺部組織中培養(yǎng)不出分枝桿菌,但經(jīng)過地塞米松的免疫抑制劑干預(yù)后引起分枝桿菌的大量暴發(fā),可以從肺臟中培養(yǎng)出大量的分枝桿菌。 4.利用建立的家兔肺部卡介苗潛伏感染模型,對融合蛋白疫苗的治療效果進(jìn)行評價(jià),發(fā)現(xiàn)疫苗組家兔肺部載菌量(EAMM組7.9×103；F6+H83組3.2×103；EAMM+F6+H83組1.6×103)均明顯低于對照組(BCG組1.2×105；佐劑組5.7×104),p值均小于0.05, p(EAMM vs BCG)=0.0015,p(F6+H83vs BCG=0.0015, p(EAMM+F6+H83vs BCG)=0.0001, p(EAMM vs佐劑)=0.0368,p(F6+H83vs佐劑)=0.00326,p(EAMM+F6+H83vs佐劑)=0.0001；EAMM+F6+H83組家兔肺部載菌量明顯低于EAMM組或F6+H83組,p(EAMM+F6+H83vs EAMM)=0.00003, p(EAMM+F6+H83vs F6+H83)=0.0216,而F6+H83聯(lián)合疫苗組家兔肺部載菌量明顯低于EAMM組,p(F6+H83vs EAMM)=0.0209。 結(jié)論： 1.家兔肺部卡介苗潛伏感染模型可以用于融合蛋白疫苗的結(jié)核治療作用初步評價(jià)；家兔肺部BCG潛伏感染模型提供了一個(gè)簡單易行并且安全有效的結(jié)核治療效果評價(jià)模型,為今后結(jié)核疫苗、抗結(jié)核藥物及相關(guān)的免疫調(diào)節(jié)劑的結(jié)核治療作用研究打下基礎(chǔ)。 2.新構(gòu)建的結(jié)核融合蛋白疫苗(F6+H83)對于潛伏狀態(tài)的BCG有一定的清除能力。 3.以結(jié)核菌潛伏狀態(tài)下高表達(dá)的抗原為基礎(chǔ)構(gòu)建的疫苗(F6+H83)和以結(jié)核菌生長狀態(tài)下高表達(dá)的抗原為基礎(chǔ)構(gòu)建的疫苗(EAMM)聯(lián)合使用可以明顯降低家兔肺部潛伏存在的BCG。
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【學(xué)位授予單位】：蘭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R392

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號：1445097