本文關鍵詞：p53在中波紫外線誘導人皮膚成纖維細胞提前衰老中的調控作用及腫瘤抑制作用的研究探討　出處：《南京醫(yī)科大學》2008年博士論文　論文類型：學位論文

  更多相關文章： 中波紫外線 人皮膚成纖維細胞 衰老 應激誘導的提前衰老 p53 凋亡 腫瘤發(fā)生 RNA干擾 過表達

【摘要】： 中波紫外線(ultraviolet B,UVB)可誘導皮膚腫瘤發(fā)生,又可誘導人皮膚成纖維細胞(humn skin fibroblast,HSF)發(fā)生應激誘導的提前衰老(stressinducedpremature senescence,SIPS)。目前認為細胞衰老是抑制腫瘤發(fā)生的機制之一,抑癌基因p53是其中關鍵的調控因子,但是在UVB誘導的細胞衰老中未見報道,因此,研究p53在UVB誘導的提前衰老中的調控作用和腫瘤抑制作用具有重要的意義。本研究分四個部分探討了UVB照射誘導HSF發(fā)生SIPS中p53的調控作用及腫瘤抑制作用。 研究目的:第一部分探討中波紫外線(UVB)誘導人皮膚成纖維細胞(HSF)衰老與UVB輻射劑量的關系,建立UVB誘導的成纖維細胞早衰模型,為深入研究UVB誘導的細胞衰老與腫瘤發(fā)生的關系奠定基礎。第二部分探討UVB誘導SIPS后細胞周期調控的變化。探討p53相關的生長停滯、細胞凋亡和腫瘤發(fā)生相關基因表達在UVB誘導的SIPS中的變化情況。初步探討UVB誘導SIPS在腫瘤發(fā)生機制中的作用。第三部分,轉染針對p53的短發(fā)夾RNA(short hairpin RNA,shRNA)質粒建立抑制p53表達的HSF細胞系。探討抑制p53表達對UVB誘導HSF發(fā)生SIPS及其腫瘤抑制作用的影響。第四部分建立穩(wěn)定過表達野生型p53基因(wtp53)的人皮膚成纖維細胞系。探討過表達p53對UVB誘導SIPS及其腫瘤抑制作用的影響。 研究方法:1.以亞毒性劑量UVB反復照射HSF以誘導其衰老。2.衰老相關的β-半乳糖苷酶(senescence-associatedβ-galactosidase,SAβ-gal)染色法檢測照射后細胞的SAβ-gal活性。3.四甲基偶氮唑鹽微量酶反應比色法(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT法)檢測HSF經UVB輻射后的細胞增殖情況。4.逆轉錄聚合酶鏈反應(reverse transcription-polymerase chainraction,RT-PCR)檢測三種衰老相關基因即纖維結合素(fibronectin,FN),骨結合素(osteonectin,ON)和平滑肌22(smooth muscle 22,SM22)基因的表達。5.流式細胞儀檢測細胞周期。6.蛋白印跡法(western blot,WB)檢測細胞周期蛋白p53、p21、p16的表達。7.實時熒光定量PCR芯片的方法檢測與p53相關的生長停滯,凋亡及腫瘤發(fā)生相關的基因的mRNA表達水平。包括p53、p21、p16、p19、bax、bcl-2、缺氧誘導因子1α(hypoxia-induciblefactor 1 alpha subunit,HIF-1α)、血管內皮生長因子(vascular endothelialgrowth factor,VEGF)、人雙微球蛋白2基因(human double minute 2,hdm2)等。8.在脂質體lipofectamine~(TM)2000介導下,分別將p53的shRNA的真核表達質粒pGCsi-p53和含有野生型p53的真核表達質粒pCMV-p53導入HSF中,經G418篩選抗性克隆,擴大培養(yǎng),建立穩(wěn)定轉染克隆細胞系。用RT-PCR、WB和實時定量PCR分析目的基因及其蛋白表達。9.建立的抑制p53表達和p53過表達的HSF模型分別在UVB照射后進行SAβ-gal染色、MTT法、實時熒光定量PCR芯片測定。 研究結果: 第一部分:篩選出適宜的誘導衰老的劑量和次數(shù),以10 mJ/cm~2的亞毒性UVB劑量連續(xù)5次照射HSF后,衰老的生物學特征得以明顯表現(xiàn),包括細胞生長停滯,SAβ-gal活性,衰老相關基因的表達等。在建立的衰老模型中,第一,MTT法檢測顯示了細胞增生能力的減弱;第二,具有SAβ-gal活性的陽性細胞明顯增加;第三,三種衰老相關基因,FN,ON和SM22的表達亦明顯增強。 第二部分:流式細胞儀對UVB誘導的SIPS模型進行細胞周期檢測發(fā)現(xiàn),大部分細胞發(fā)生了G1期阻滯;衰老通路中p53,p21和p16的表達都明顯增加;實時熒光定量PCR芯片檢測發(fā)現(xiàn),與生長停滯相關的抑癌基因p53、p21、p16、p19的表達均上調;p53下游的凋亡相關基因中的抑凋亡基因bcl-2表達稍上調,而凋亡基因bax表達下調;在腫瘤發(fā)生相關基因中,癌基因HIF-1α、VEGF、hdm2的表達均下調。 第三部分:成功建立RNA干擾抑制p53表達的HSF細胞系,轉染細胞中p53基因及蛋白水平明顯下調。抑制p53表達的細胞株經UVB照射后SAβ-gal活性降低,具有抑制UVB誘導的細胞生長停滯的作用。腫瘤發(fā)生相關基因檢測結果表明抑制p53表達可抑制衰老基因的表達,但p16通路并不受之影響,在UVB作用下仍可發(fā)揮作用。抑制p53的表達可使抑凋亡基因bcl-2上調及促凋亡基因bax下調,癌基因HIF-1α、VEGF、hdm2表達明顯增加。這些p53依賴的細胞凋亡和抑制腫瘤作用被抑制。UVB照射與否對這兩種作用無明顯影響。 第四部分:成功建立過表達p53的HSF細胞系,轉染細胞中存在p53基因及蛋白的穩(wěn)定過表達。過表達p53的細胞株經UVB照射后SAβ-gal活性未見增高,對UVB誘導的細胞生長停滯的影響并不顯著。腫瘤發(fā)生相關基因檢測結果表明過表達p53未能提高衰老基因的表達;過表達p53可使抑凋亡基因bcl-2下調及促凋亡基因bax上調;癌基因HIF-1α、VEGF、hdm2表達明顯降低。這些p53依賴的細胞凋亡和抑制腫瘤作用因p53的過表達而更為顯著。UVB照射可加強這兩種作用。 結論: 第一部分:反復亞毒性劑量UVB照射HSF可誘導其SIPS發(fā)生,表現(xiàn)出與復制衰老(RS)的成纖維細胞許多共同的特征。實驗成功建立了一種UVB誘導的HSF的SIPS模型,可用于進一步的相關研究。 第二部分:G1期阻滯和衰老信號通路蛋白表達增加進一步印證了UVB誘導HSF發(fā)生的SIPS。p53信號通路相關基因的表達變化提示UVB誘導的SIPS可能具有與p53相關的抗凋亡和腫瘤抑制的作用,但其中p53信號通路所起的作用還需更進一步的實驗探索。 第三部分:抑制p53表達能夠延遲或部分抑制HSF的復制衰老和UVB誘導的SIPS。UVB誘導的SIPS中的部分腫瘤抑制機制確由p53所調控,抑制p53表達可使部分p53依賴的細胞凋亡和抑制腫瘤作用明顯缺失,從而有助于腫瘤的發(fā)生。 第四部分:過表達p53不能促進HSF的復制衰老和UVB誘導的SIPS。過表達p53可使p53依賴的細胞凋亡和抑制腫瘤作用明顯增強,UVB還可加強這種作用,從而有助于抑制腫瘤發(fā)生。在UVB作用下,過表達p53可能更傾向于誘導凋亡而非衰老。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：南京醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2008
【分類號】：R363

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