本文關(guān)鍵詞：p53在中波紫外線誘導(dǎo)人皮膚成纖維細(xì)胞提前衰老中的調(diào)控作用及腫瘤抑制作用的研究探討　出處：《南京醫(yī)科大學(xué)》2008年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】： 中波紫外線(ultraviolet B,UVB)可誘導(dǎo)皮膚腫瘤發(fā)生,又可誘導(dǎo)人皮膚成纖維細(xì)胞(humn skin fibroblast,HSF)發(fā)生應(yīng)激誘導(dǎo)的提前衰老(stressinducedpremature senescence,SIPS)。目前認(rèn)為細(xì)胞衰老是抑制腫瘤發(fā)生的機(jī)制之一,抑癌基因p53是其中關(guān)鍵的調(diào)控因子,但是在UVB誘導(dǎo)的細(xì)胞衰老中未見報道,因此,研究p53在UVB誘導(dǎo)的提前衰老中的調(diào)控作用和腫瘤抑制作用具有重要的意義。本研究分四個部分探討了UVB照射誘導(dǎo)HSF發(fā)生SIPS中p53的調(diào)控作用及腫瘤抑制作用。 研究目的:第一部分探討中波紫外線(UVB)誘導(dǎo)人皮膚成纖維細(xì)胞(HSF)衰老與UVB輻射劑量的關(guān)系,建立UVB誘導(dǎo)的成纖維細(xì)胞早衰模型,為深入研究UVB誘導(dǎo)的細(xì)胞衰老與腫瘤發(fā)生的關(guān)系奠定基礎(chǔ)。第二部分探討UVB誘導(dǎo)SIPS后細(xì)胞周期調(diào)控的變化。探討p53相關(guān)的生長停滯、細(xì)胞凋亡和腫瘤發(fā)生相關(guān)基因表達(dá)在UVB誘導(dǎo)的SIPS中的變化情況。初步探討UVB誘導(dǎo)SIPS在腫瘤發(fā)生機(jī)制中的作用。第三部分,轉(zhuǎn)染針對p53的短發(fā)夾RNA(short hairpin RNA,shRNA)質(zhì)粒建立抑制p53表達(dá)的HSF細(xì)胞系。探討抑制p53表達(dá)對UVB誘導(dǎo)HSF發(fā)生SIPS及其腫瘤抑制作用的影響。第四部分建立穩(wěn)定過表達(dá)野生型p53基因(wtp53)的人皮膚成纖維細(xì)胞系。探討過表達(dá)p53對UVB誘導(dǎo)SIPS及其腫瘤抑制作用的影響。 研究方法:1.以亞毒性劑量UVB反復(fù)照射HSF以誘導(dǎo)其衰老。2.衰老相關(guān)的β-半乳糖苷酶(senescence-associatedβ-galactosidase,SAβ-gal)染色法檢測照射后細(xì)胞的SAβ-gal活性。3.四甲基偶氮唑鹽微量酶反應(yīng)比色法(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT法)檢測HSF經(jīng)UVB輻射后的細(xì)胞增殖情況。4.逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcription-polymerase chainraction,RT-PCR)檢測三種衰老相關(guān)基因即纖維結(jié)合素(fibronectin,FN),骨結(jié)合素(osteonectin,ON)和平滑肌22(smooth muscle 22,SM22)基因的表達(dá)。5.流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期。6.蛋白印跡法(western blot,WB)檢測細(xì)胞周期蛋白p53、p21、p16的表達(dá)。7.實時熒光定量PCR芯片的方法檢測與p53相關(guān)的生長停滯,凋亡及腫瘤發(fā)生相關(guān)的基因的mRNA表達(dá)水平。包括p53、p21、p16、p19、bax、bcl-2、缺氧誘導(dǎo)因子1α(hypoxia-induciblefactor 1 alpha subunit,HIF-1α)、血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelialgrowth factor,VEGF)、人雙微球蛋白2基因(human double minute 2,hdm2)等。8.在脂質(zhì)體lipofectamine~(TM)2000介導(dǎo)下,分別將p53的shRNA的真核表達(dá)質(zhì)粒pGCsi-p53和含有野生型p53的真核表達(dá)質(zhì)粒pCMV-p53導(dǎo)入HSF中,經(jīng)G418篩選抗性克隆,擴(kuò)大培養(yǎng),建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染克隆細(xì)胞系。用RT-PCR、WB和實時定量PCR分析目的基因及其蛋白表達(dá)。9.建立的抑制p53表達(dá)和p53過表達(dá)的HSF模型分別在UVB照射后進(jìn)行SAβ-gal染色、MTT法、實時熒光定量PCR芯片測定。 研究結(jié)果: 第一部分:篩選出適宜的誘導(dǎo)衰老的劑量和次數(shù),以10 mJ/cm~2的亞毒性UVB劑量連續(xù)5次照射HSF后,衰老的生物學(xué)特征得以明顯表現(xiàn),包括細(xì)胞生長停滯,SAβ-gal活性,衰老相關(guān)基因的表達(dá)等。在建立的衰老模型中,第一,MTT法檢測顯示了細(xì)胞增生能力的減弱;第二,具有SAβ-gal活性的陽性細(xì)胞明顯增加;第三,三種衰老相關(guān)基因,FN,ON和SM22的表達(dá)亦明顯增強(qiáng)。 第二部分:流式細(xì)胞儀對UVB誘導(dǎo)的SIPS模型進(jìn)行細(xì)胞周期檢測發(fā)現(xiàn),大部分細(xì)胞發(fā)生了G1期阻滯;衰老通路中p53,p21和p16的表達(dá)都明顯增加;實時熒光定量PCR芯片檢測發(fā)現(xiàn),與生長停滯相關(guān)的抑癌基因p53、p21、p16、p19的表達(dá)均上調(diào);p53下游的凋亡相關(guān)基因中的抑凋亡基因bcl-2表達(dá)稍上調(diào),而凋亡基因bax表達(dá)下調(diào);在腫瘤發(fā)生相關(guān)基因中,癌基因HIF-1α、VEGF、hdm2的表達(dá)均下調(diào)。 第三部分:成功建立RNA干擾抑制p53表達(dá)的HSF細(xì)胞系,轉(zhuǎn)染細(xì)胞中p53基因及蛋白水平明顯下調(diào)。抑制p53表達(dá)的細(xì)胞株經(jīng)UVB照射后SAβ-gal活性降低,具有抑制UVB誘導(dǎo)的細(xì)胞生長停滯的作用。腫瘤發(fā)生相關(guān)基因檢測結(jié)果表明抑制p53表達(dá)可抑制衰老基因的表達(dá),但p16通路并不受之影響,在UVB作用下仍可發(fā)揮作用。抑制p53的表達(dá)可使抑凋亡基因bcl-2上調(diào)及促凋亡基因bax下調(diào),癌基因HIF-1α、VEGF、hdm2表達(dá)明顯增加。這些p53依賴的細(xì)胞凋亡和抑制腫瘤作用被抑制。UVB照射與否對這兩種作用無明顯影響。 第四部分:成功建立過表達(dá)p53的HSF細(xì)胞系,轉(zhuǎn)染細(xì)胞中存在p53基因及蛋白的穩(wěn)定過表達(dá)。過表達(dá)p53的細(xì)胞株經(jīng)UVB照射后SAβ-gal活性未見增高,對UVB誘導(dǎo)的細(xì)胞生長停滯的影響并不顯著。腫瘤發(fā)生相關(guān)基因檢測結(jié)果表明過表達(dá)p53未能提高衰老基因的表達(dá);過表達(dá)p53可使抑凋亡基因bcl-2下調(diào)及促凋亡基因bax上調(diào);癌基因HIF-1α、VEGF、hdm2表達(dá)明顯降低。這些p53依賴的細(xì)胞凋亡和抑制腫瘤作用因p53的過表達(dá)而更為顯著。UVB照射可加強(qiáng)這兩種作用。 結(jié)論: 第一部分:反復(fù)亞毒性劑量UVB照射HSF可誘導(dǎo)其SIPS發(fā)生,表現(xiàn)出與復(fù)制衰老(RS)的成纖維細(xì)胞許多共同的特征。實驗成功建立了一種UVB誘導(dǎo)的HSF的SIPS模型,可用于進(jìn)一步的相關(guān)研究。 第二部分:G1期阻滯和衰老信號通路蛋白表達(dá)增加進(jìn)一步印證了UVB誘導(dǎo)HSF發(fā)生的SIPS。p53信號通路相關(guān)基因的表達(dá)變化提示UVB誘導(dǎo)的SIPS可能具有與p53相關(guān)的抗凋亡和腫瘤抑制的作用,但其中p53信號通路所起的作用還需更進(jìn)一步的實驗探索。 第三部分:抑制p53表達(dá)能夠延遲或部分抑制HSF的復(fù)制衰老和UVB誘導(dǎo)的SIPS。UVB誘導(dǎo)的SIPS中的部分腫瘤抑制機(jī)制確由p53所調(diào)控,抑制p53表達(dá)可使部分p53依賴的細(xì)胞凋亡和抑制腫瘤作用明顯缺失,從而有助于腫瘤的發(fā)生。 第四部分:過表達(dá)p53不能促進(jìn)HSF的復(fù)制衰老和UVB誘導(dǎo)的SIPS。過表達(dá)p53可使p53依賴的細(xì)胞凋亡和抑制腫瘤作用明顯增強(qiáng),UVB還可加強(qiáng)這種作用,從而有助于抑制腫瘤發(fā)生。在UVB作用下,過表達(dá)p53可能更傾向于誘導(dǎo)凋亡而非衰老。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號】：R363

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