本文關鍵詞：CTLA4Ig修飾樹突狀細胞誘導對氧化修飾低密度脂蛋白免疫耐受的實驗研究　出處：《山東大學》2008年博士論文　論文類型：學位論文

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【摘要】： 第一部分CTLA4Ig誘導T細胞對氧化修飾低密度脂蛋白免疫無能的研究 目的:目前研究認為,動脈粥樣硬化是一種炎癥性疾病,免疫應答是引起機體炎癥反應的重要因素。樹突狀細胞(dendritic cell,DC)、T淋巴細胞和氧化修飾低密度脂蛋白(oxidized-loW density lipoprotein,ox-LDL)均參與了致動脈粥樣硬化的免疫反應。本研究擬采用融合蛋白CTLA4Ig阻斷DC上B7與T細胞上CD28結合而傳遞的共刺激信號,誘導T細胞對ox-LDL的免疫無能,并對機理進行初步探討,以期發(fā)現(xiàn)防治動脈粥樣硬化的新策略。 方法:分離外周血單個核細胞,黏附法分離單核細胞,加入rhGM-CSF(500IU/ml)和rhIL-4(500 IU/ml)培養(yǎng)6天以誘導DC。在DC中分別加入PBS、LDL(10μg/ml)、ox-LDL(10μg/ml)和LPS(30 ng/ml),作用48小時,流式細胞法檢測CD86、HLA-DR等細胞標志。ELISA法檢測上清中IL-12的含量。取刺激后的DC與同種異體T淋巴細胞行混合淋巴細胞反應(mixed lymphocytereaction,MLR),ox-LDL組分別加入不同濃度的CTLA4Ig(0、0.31、0.62、1.25μg/ml),MTT法檢測T細胞的增殖。分別以流式細胞法和酶聯(lián)免疫斑點(ELISpot)法檢測MLR中T細胞CD25的表達、T細胞的凋亡和細胞因子分泌情況。 結果:1、LPS和ox-LDL可以促進DC分泌IL-12,較PBS和LDL有顯著性差異。CD86(B7)熒光表達率在LPS和ox-LDL10μg/ml刺激后較對照組(PBS組)均有明顯升高(P＜0.05)。HLA-DR(MHC-Ⅱ)的表達中也有相同的表現(xiàn)。CD86和HLA-DR的MFI在oxLDL(10μg/ml)刺激后明顯高于對照組(P＜0.05)。2、ox-LDL負載的DC可明顯刺激MLR中的T細胞增殖,SI與PBS組和LDL組比較,均有顯著性差異(P＜0.05)。3、ox-LDL能促進MLR中T細胞分泌IL-2和IFNV(Th1樣細胞因子),較PBS組和LDL組明顯升高(P＜0.05)。ox-LDL也能促進MLR中T細胞分泌IL-4(Th2樣細胞因子),較PBS組和LDL組明顯升高(P＜0.05)。4、CTLA4-Ig可抑制ox-LDL激發(fā)的同種異體MLR中T細胞增殖反應,與未應用CTLA4Ig組比較有顯著性差異(P＜0.05,P＜0.01)。5、CTLA4-Ig可明顯抑制ox-LDL激發(fā)的同種異體MLR中T細胞CD25的陽性率,與未應用CTLA4Ig組比較有顯著性差異(P＜0.05,P＜0.01)。6、應用CTLA4Ig后,淋巴細胞出現(xiàn)一定程度的凋亡,與未用CTLA4Ig比較有顯著性差異(P＜0.01)。7、CTLA4Ig減少IL-2和IFN Y的ELISpot斑點數(shù),較未應用組有顯著性差異(P＜0.05,P＜0.01);CTLA4Ig增加IL-4的斑點數(shù),較未應用組有顯著性差異(P＜0.05)。 結論:1、ox-LDL可以促進DC的表型成熟,激發(fā)MLR,證明ox-LDL是一種抗原物質:2、ox-LDL負載的DC激發(fā)的MLR中既有Th1型免疫應答,也有Th2型免疫應答;3、CTLA4Ig可以在體外誘導T細胞對ox-LDL的免疫無能;4、CTLA4Ig可以促進ox-LDL負載的DC激發(fā)的MLR中的Th1/Th2偏移;5、CTLA4Ig可以抑制ox-LDL負載的DC激發(fā)的MLR中的T細胞活化;6、CTLA4Ig可以促進ox-LDL負載的DC激發(fā)的MLR中的T細胞凋亡。 第二部分CTLA4Ig基因轉染對樹突狀細胞針對氧化修飾低密度脂蛋白免疫功能的影響 目的:目前研究認為,動脈粥樣硬化是一種炎癥性疾病,DC與動脈粥樣硬化發(fā)生和發(fā)展的病理過程密切相關,干預DC功能可能成為防治動脈粥樣硬化的重要措施。CTLA4Ig可與抗原遞呈細胞的B7-1/2分子結合,阻斷抗原遞呈細胞和抗原特異性T淋巴細胞之間的共刺激信號傳遞。CTLA4Ig基因轉染DC在移植實驗中可以誘導機體對移植物抗原的免疫耐受。本研究擬采用人外周血單個核細胞誘導的DC為研究對象,研究含CTLA4Ig基因腺病毒(Ad-CTLA4Ig)轉染DC對動脈粥樣硬化相關抗原-ox-LDL免疫反應的影響,以期在體外誘導對ox-LDL的免疫耐受,為進一步的動物實驗提供基礎。 方法:分離外周血單個核細胞,黏附法分離單核細胞,加入rhGM-CSF(500IU/ml)和rhIL-4(500 IU/ml)培養(yǎng)4天,用Ad-CTLA4Ig分別以感染指數(shù)(multiplicity of infection,MOI)=100,MOI=200和MOI=300感染DC,以含強化綠色熒光蛋白(Ad-EGFP)轉染DC和未轉染的DC為對照,繼續(xù)培養(yǎng)4天。ELISA法檢測上清CTLA4Ig的含量。熒光顯微鏡、流式細胞法和免疫印跡(Western blot)法檢測CTLA4Ig的表達情況。取轉染3天后的DC,加入ox-LDL(10ug/ml),繼續(xù)培養(yǎng)48hr。ELISA法檢測上清IL-12含量。流式細胞法檢測CD86和HLA-DR的表達率。取ox-LDL刺激48hr的基因轉染DC、未轉染DC及加入10ug/mlCTLA4Ig的未轉染DC,與同種異體淋巴細胞行MLR,MTT法檢測T細胞的增殖。分別以流式細胞法和酶聯(lián)免疫斑點(ELISpot)法檢測MLR中T細胞CD25的表達、T細胞的凋亡和細胞因子分泌情況。 結果:1、CTLA4Ig表達率隨著時間逐漸增高,在轉染后72小時達到高峰。MOI=200時轉染率最高。2、CTLA4Ig基因轉染DC經(jīng)ox-LDL刺激后,IL-12的分泌量明顯低于Ad-EGFP轉染DC(P＜0.05)和未轉染DC(P＜0.05)。3、CTLA4Ig基因轉染DC CD86和HLA-DR的表達率明顯降低,以CD86的降低明顯(P＜0.05)。4、CTLA4Ig基因轉染DC在MLR中的SI均明顯低于未轉染DC和Ad-EGFP轉染DC(分別P＜0.05)。5、在ox-LDL負載的CTLA4Ig基因轉染DC激發(fā)的MLR中,CD25的表達率較未轉染DC和Ad-EGFP轉染DC明顯降低(P＜0.05)。6、在ox-LDL負載的CTLA4Ig基因轉染DC激發(fā)的MLR中,T細胞凋亡率較未轉染DC和Ad-EGFP轉染DC明顯增高(P＜0.01)。7、在CTLA4Ig基因轉染DC激發(fā)的MLR中,T細胞分泌的IL-2和IFNγ較空白對照和Ad-EGFP轉染DC明顯降低(均P＜0.05)。T細胞分泌的IL-4較空白對照和Ad-EGFP轉染DC明顯升高(P＜0.05)。 結論:1、Ad-CTLA4Ig轉染人DC的最佳MOI=200,最佳表達時相為轉染后72小時。2、Ad-CTLA4Ig轉染可以降低DC負載ox-LDL后IL-12的分泌,降低CD86和HLA-DR的表達率和刺激MLR的能力,使DC保持一定的未成熟狀態(tài)。3、Ad-CTLA4Ig轉染DC可以在體外誘導對動脈粥樣硬化抗原ox-LDL的免疫耐受。4、Ad-CTLA4Ig轉染DC通過降低T細胞的激活、促進T細胞凋亡和促進免疫應答的Th1/Th2偏移等機制來誘導對ox-LDL的免疫耐受。
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【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2008
【分類號】：R392

【參考文獻】

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本文編號：1432180