本文關(guān)鍵詞：KLF4在全反式維甲酸誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞分化中的作用及機(jī)制研究　出處：《河北醫(yī)科大學(xué)》2008年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】： 血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cell, VSMC)在血管損傷因素刺激下可從分化型轉(zhuǎn)化為去分化型并獲得增殖能力,這個(gè)過程稱為表型轉(zhuǎn)化。VSMC表型轉(zhuǎn)化是其進(jìn)行增殖和遷移的先決條件,是高血壓、動(dòng)脈粥樣硬化和血管再狹窄等血管重塑性疾病的細(xì)胞病理學(xué)基礎(chǔ)。既往研究已經(jīng)證明,去分化型VSMC在全反式維甲酸(all-trans retinoic acid,ATRA)作用下可進(jìn)行分化,并重新獲得收縮能力,然而ATRA誘導(dǎo)VSMC分化的分子機(jī)制尚不清楚。闡明VSMC表型轉(zhuǎn)化的調(diào)控機(jī)制,對(duì)防治血管重塑和逆轉(zhuǎn)增殖性血管病變具有重要的意義。 ATRA是一種維生素A的衍生物,通過與胞內(nèi)受體RAR/RXR相互作用而發(fā)揮對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)、分化和凋亡的調(diào)節(jié)作用。然而,目前對(duì)ATRA抑制VSMC增殖及促進(jìn)VSMC分化作用的研究尚少。krüpple樣因子(krüpple-like factor,GKLF/KLF4)是KLF家族中與胚胎發(fā)育、細(xì)胞分化和癌癥發(fā)生密切相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子。我室以往的研究證實(shí), ATRA可顯著誘導(dǎo)KLF4表達(dá)及促進(jìn)體外培養(yǎng)的去分化型VSMC進(jìn)行分化,但KLF4在ATRA誘導(dǎo)VSMC分化中的作用及機(jī)制尚不清楚。 為了闡明KLF4在ATRA誘導(dǎo)VSMC分化中的作用及其分子機(jī)制,本文在系統(tǒng)研究ATRA對(duì)VSMC增殖、遷移、收縮等生物學(xué)行為以及分化和去分化標(biāo)志基因表達(dá)的影響的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步探討KLF4過表達(dá)及基因沉默對(duì)VSMC表型及細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下: 1 ATRA對(duì)VSMC分化的影響 本部分實(shí)驗(yàn)以VSMC分化和去分化標(biāo)志基因表達(dá)作為判斷VSMC表型的指標(biāo),檢測(cè)ATRA對(duì)VSMC表型及增殖、遷移和收縮的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下: 1.1 ATRA對(duì)VSMC形態(tài)和生物學(xué)行為的影響 MTT分析、細(xì)胞計(jì)數(shù)、細(xì)胞跨膜遷移和傷口愈合實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,ATRA能以濃度(5、10、20μmol/L)和時(shí)間(24、48、72 h)依賴的方式抑制VSMC增殖和遷移,以ATRA濃度為10μmol/L作用于VSMC48 h的抑制作用最強(qiáng)。 10μmol/L ATRA作用于細(xì)胞48 h,可使VSMC形態(tài)從鵝卵石狀轉(zhuǎn)變?yōu)榧?xì)長(zhǎng)梭型的極性排列狀態(tài),類似于血管壁中有機(jī)組裝的VSMC形態(tài)。同時(shí),在乙酰膽堿(100μmol/L)刺激下,與對(duì)照組相比,ATRA處理的VSMC長(zhǎng)度明顯縮短,而在同樣刺激條件下,常規(guī)培養(yǎng)的VSMC對(duì)乙酰膽堿刺激所產(chǎn)生的收縮反應(yīng)并不明顯。 1.2 ATRA對(duì)VSMC分化標(biāo)志基因SM22α和SMα-actin以及去分化標(biāo)志基因SMemb表達(dá)的影響 分化標(biāo)志基因SM22α和SMα-actin(α-SMA)是VSMC處于分化狀態(tài)的重要的分子標(biāo)志,而去分化標(biāo)志基因embryonic vascular smooth muscle myosin heavy chain-B(SMemb)則是VSMC處于去分化狀態(tài)的重要標(biāo)志。采用RT-PCR、Western blot和細(xì)胞免疫化學(xué)方法,分別從轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平觀察了各種標(biāo)志基因在ATRA誘導(dǎo)VSMC分化過程中的表達(dá)變化。結(jié)果顯示,在ATRA處理的VSMC中,分化標(biāo)志基因SM22α和α-SMA表達(dá)明顯升高,而去分化標(biāo)志基因SMemb表達(dá)顯著降低,具有明顯的濃度和時(shí)間的依賴效應(yīng)。其中,濃度為10μmol/L和時(shí)間為48 h時(shí)具有顯著變化。 2 KLF4在ATRA誘導(dǎo)VSMC分化中的作用 對(duì)多種細(xì)胞系的研究表明,KLF4是一個(gè)重要的與細(xì)胞生長(zhǎng)、分化和凋亡調(diào)節(jié)有關(guān)的基因。但KLF4是否參與ATRA誘導(dǎo)的VSMC分化以及在VSMC表型調(diào)控中發(fā)揮怎樣的作用,目前尚不清楚。本部分實(shí)驗(yàn)觀察大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮剝脫和ATRA誘導(dǎo)VSMC分化過程中KLF4的表達(dá)變化,以及KLF4過表達(dá)和KLF4基因敲減對(duì)VSMC分化和去分化標(biāo)志基因表達(dá)及細(xì)胞表型的影響。 2.1血管新生內(nèi)膜中KLF4的表達(dá)變化 RT-PCR和Western blot分析結(jié)果顯示,血管內(nèi)皮剝脫3天后,血管組織中KLF4蛋白和mRNA水平均明顯升高。 2.2 ATRA對(duì)KLF4表達(dá)的影響 RT-PCR、Western blot結(jié)果表明,ATRA可顯著誘導(dǎo)KLF4表達(dá),并具有明顯的時(shí)效(24、48、72 h)和量效(5、10、20μmol/L)關(guān)系, 10μmol/L ATRA作用于VSMC 48 h出現(xiàn)顯著差異。細(xì)胞免疫化學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示,在10μmol/L ATRA刺激48 h的VSMC中,KLF4的表達(dá)明顯高于對(duì)照組。 2.3 KLF4過表達(dá)對(duì)VSMC分化及去分化標(biāo)志基因表達(dá)的影響 以KLF4腺病毒表達(dá)載體Ad-KLF4感染VSMC 48 h,經(jīng)Western blot檢測(cè)證實(shí)KLF4在VSMC中得到高效表達(dá)。被KLF4腺病毒感染的VSMC變成梭形,并對(duì)乙酰膽堿刺激的反應(yīng)性明顯高于腺病毒空載體感染的細(xì)胞。 RT-PCR、Western blot和免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示,在KLF4過表達(dá)的VSMC中,分化標(biāo)志基因SM22α和α-SMA的表達(dá)明顯高于空載體對(duì)照組,而去分化標(biāo)志基因SMemb的表達(dá)則明顯低于對(duì)照細(xì)胞。 SM22α和α-SMA啟動(dòng)子區(qū)存在KLF4的結(jié)合位點(diǎn),在以染色質(zhì)免疫沉淀實(shí)驗(yàn)(ChIP)證明KLF4結(jié)合于它們的啟動(dòng)子后,我們進(jìn)行了SM22α啟動(dòng)子指導(dǎo)的報(bào)告基因分析,結(jié)果表明,KLF4可明顯增強(qiáng)SM22α啟動(dòng)子的活性。 2.4 KLF4基因敲減對(duì)VSMC分化及去分化標(biāo)志基因表達(dá)的影響 將KLF4特異性小干擾RNA(small interfering RNA,siRNA)導(dǎo)入VSMC,阻斷內(nèi)源性KLF4的表達(dá),進(jìn)一步研究KLF4在ATRA誘導(dǎo)VSMC分化中的作用。RT-PCR和Western blot分析結(jié)果顯示,KLF4-siRNA導(dǎo)入可敲減KLF4表達(dá)70%以上。 RT-PCR、Western blot和免疫細(xì)胞化學(xué)分析結(jié)果顯示,在ATRA刺激下,敲低KLF4表達(dá)的VSMC中分化標(biāo)志基因SM22α和α-SMA的表達(dá)被明顯削弱,相反,去分化標(biāo)志基因SMemb的表達(dá)顯著增強(qiáng)。而未經(jīng)ATRA處理的VSMC,敲除KLF4并不能引起分化和去分化標(biāo)志基因表達(dá)的明顯變化。同時(shí),敲低KLF4表達(dá)的VSMC即使經(jīng)ATRA刺激也呈現(xiàn)一定程度的去分化狀態(tài),并對(duì)乙酰膽堿刺激誘發(fā)的收縮反應(yīng)明顯減弱。 3 KLF4在ATRA抑制VSMC遷移中的作用 VSMC增殖及其從血管中膜向內(nèi)膜遷移是動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成和血管成形術(shù)后再狹窄的主要原因。研究證明,VSMC的遷移與細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的降解密切相關(guān)�；|(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs)是分解ECM的蛋白酶,在血管組織中以MMP-2和MMP-9最為重要。本部分觀察KLF4過表達(dá)與敲低表達(dá)對(duì)VSMC遷移活性的影響及其與MMP-2和MMP-9表達(dá)之間的關(guān)系。 3.1 KLF4在VSMC遷移中發(fā)揮重要作用 第一部分的實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí),ATRA可顯著抑制VSMC的遷移活性,為進(jìn)一步弄清ATRA抑制VSMC遷移是否與KLF4表達(dá)有關(guān),本部分實(shí)驗(yàn)首先用KLF4 siRNA敲減內(nèi)源性KLF4表達(dá),然后觀察ATRA對(duì)VSMC遷移活性的影響。結(jié)果表明,KLF4基因敲減可使ATRA對(duì)VSMC遷移的抑制作用明顯減弱;與此一致,KLF4過表達(dá)使VSMC遷移活性降低,表明KLF4在ATRA抑制VSMC遷移的過程中發(fā)揮重要作用。 3.2 ATRA對(duì)MMP-2和MMP-9表達(dá)和活性的影響 為了闡明ATRA抑制VSMC遷移是否與調(diào)節(jié)MMP-2和MMP-9基因表達(dá)有關(guān),接下來我們檢查了ATRA對(duì)這兩種基因表達(dá)的影響。Western blot和RT-PCR結(jié)果顯示,10μmol/L ATRA處理VSMC 48 h可明顯降低MMP-2和MMP-9的表達(dá)。酶圖分析結(jié)果顯示,ATRA處理也明顯降低MMP-2和MMP-9的膠原酶活性,其中以MMP-2的活性降低更為明顯。提示ATRA抑制VSMC遷移與抑制MMP-2和MMP-9的表達(dá)和活性有關(guān)。 3.3 KLF4對(duì)MMP-2和MMP-9表達(dá)和活性的影響 Western blot和RT-PCR結(jié)果顯示,與對(duì)照細(xì)胞相比,腺病毒介導(dǎo)的KLF4在VSMC中過表達(dá)可明顯降低MMP-2和MMP-9的表達(dá)。酶圖分析結(jié)果顯示,KLF4過表達(dá)也明顯降低MMP-2和MMP-9分解明膠的活性,其中以MMP-2的活性降低更為明顯。用KLF4 siRNA敲減KLF4表達(dá)后,ATRA對(duì)MMP-2和MMP-9表達(dá)的抑制作用明顯降低,酶圖分析結(jié)果亦與此一致。表明KLF4抑制VSMC遷移與抑制MMP-2和MMP-9的表達(dá)和活性有關(guān)。 4 KLF4在ATRA抑制VSMC增殖中的作用 當(dāng)血管受到損傷或體外培養(yǎng)的VSMC受到生長(zhǎng)因子刺激時(shí),VSMC可從分化表型轉(zhuǎn)化為去分化表型,通過激活細(xì)胞周期進(jìn)展相關(guān)激酶,啟動(dòng)細(xì)胞周期,使VSMC進(jìn)入S期并開始增殖。周期蛋白依賴性蛋白激酶(cyclin dependent kinase, CDKs)是細(xì)胞周期進(jìn)展調(diào)控系統(tǒng)的核心,而p53是引起G1期阻滯的核心分子。本部分研究觀察KLF4對(duì)VSMC增殖的影響及其與P53和CDK4表達(dá)之間的關(guān)系。 4.1 KLF4對(duì)VSMC增殖活性的影響 MTT和細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果顯示,ATRA可顯著抑制VSMC的增殖活性,但在敲減KLF4表達(dá)后,ATRA抑制VSMC增殖的作用明顯減弱,而KLF4過表達(dá)可使VSMC增殖活性降低35 %左右,表明KLF4介導(dǎo)ATRA對(duì)VSMC增殖活性的抑制作用。 4.2 KLF4介導(dǎo)ATRA對(duì)VSMC細(xì)胞周期的阻滯作用 10μmol/L ATRA刺激VSMC 48 h可使處于S期的細(xì)胞數(shù)顯著減少,同時(shí)增加了停滯于G1期的細(xì)胞數(shù)。同樣,KLF4強(qiáng)制性表達(dá)也獲得了類似的結(jié)果。相反,用KLF4 siRNA敲低內(nèi)源性KLF4表達(dá)后,ATRA對(duì)VSMC細(xì)胞周期的阻滯作用明顯減弱。表明ATRA對(duì)VSMC細(xì)胞周期的阻滯作用與上調(diào)KLF4有關(guān)。 4.3 KLF4抑制VSMC增殖與其調(diào)節(jié)P53和CDK4表達(dá)有關(guān) Western blot和RT-PCR結(jié)果顯示,ATRA能以濃度和時(shí)間依賴的方式使P53表達(dá)上調(diào)。10μmol/L ATRA刺激48 h條件下具有顯著變化。同樣,KLF4過表達(dá)也可使P53表達(dá)顯著上調(diào),而在敲低內(nèi)源性KLF4表達(dá)后,ATRA上調(diào)P53表達(dá)的作用被明顯削弱。與此相反,ATRA處理和KLF4過表達(dá)均可抑制CDK4表達(dá),并且ATRA的抑制作用在敲低KLF4表達(dá)后明顯降低。表明ATRA抑制VSMC增殖與誘導(dǎo)KLF4表達(dá)及由此引發(fā)的P53表達(dá)上調(diào)和CDK4表達(dá)下調(diào)有關(guān)。 5 KLF4與KLF5在調(diào)節(jié)VSMC表型中的相互作用 VSMC表型轉(zhuǎn)化是多個(gè)基因表達(dá)變化的結(jié)果,其中,KLF4和KLF5是參與VSMC表型轉(zhuǎn)化的兩個(gè)重要的轉(zhuǎn)錄因子。它們是KLF家族中較為鄰近的兩個(gè)成員,具有相似的組織分布,能夠識(shí)別和結(jié)合同一順式元件,然而卻往往表現(xiàn)出相反的生物學(xué)效應(yīng)。KLF5是一個(gè)增殖促進(jìn)基因,而KLF4是一個(gè)增殖抑制基因,兩者通過對(duì)外界刺激信號(hào)的整合作用而維持細(xì)胞增殖與分化處于平衡狀態(tài)。本部分實(shí)驗(yàn)用攜帶KLF4或KLF5的腺病毒分別或共同感染VSMC,通過過表達(dá)KLF4和/或KLF5,觀察其對(duì)VSMC表型和細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。 5.1 KLF5和/或KLF4過表達(dá)對(duì)VSMC形態(tài)和生物學(xué)行為的影響 Western blot結(jié)果顯示,兩種重組腺病毒感染VSMC 48 h后,KLF5和KLF4在細(xì)胞中均得到高效表達(dá)。KLF5過表達(dá)的VSMC進(jìn)一步變圓,更加趨向于去分化狀態(tài),對(duì)乙酰膽堿刺激不能引起收縮反應(yīng),與腺病毒Ad感染的對(duì)照組相比,增殖和遷移活性明顯升高。共表達(dá)KLF4和KLF5的VSMC則趨向于變成梭形,對(duì)乙酰膽堿刺激可出現(xiàn)輕微的收縮反應(yīng),與KLF5過表達(dá)的VSMC相比,增殖和遷移活性明顯降低。而單純KLF4過表達(dá)的VSMC顯示出明顯的分化型特征,細(xì)胞呈細(xì)長(zhǎng)的梭形并集束排列,對(duì)乙酰膽堿刺激出現(xiàn)明顯的收縮反應(yīng),細(xì)胞增殖和遷移活性明顯低于Ad-KLF5和Ad-KLF4共感染組。 5.2 KLF5和/或KLF4過表達(dá)對(duì)MMP-9和MMP-2活性的影響 明膠酶圖分析結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,在KLF5過表達(dá)的VSMC培養(yǎng)基中,MMP-9和MMP-2活性明顯升高;而KLF4過表達(dá)的VSMC,MMP-9和MMP-2活性明顯降低。二者共同過表達(dá)時(shí)MMP-9和MMP-2活性亦有顯著降低。 5.3 KLF5和/或KLF4過表達(dá)對(duì)VSMC分化和去分化標(biāo)志基因表達(dá)的影響 Western blot和RT-PCR結(jié)果顯示,VSMC被Ad-KLF5感染48 h后,VSMC分化標(biāo)志基因SM22α和α-SMA表達(dá)低于對(duì)照組,KLF5與KLF4共同過表達(dá)后分化標(biāo)志基因表達(dá)明顯升高;而單純過表達(dá)KLF4后,VSMC分化標(biāo)志基因表達(dá)活性進(jìn)一步升高。同時(shí),檢測(cè)到VSMC去分化標(biāo)志基因SMemb和增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)的表達(dá)與分化標(biāo)志基因的變化相反。 以上結(jié)果表明,KLF5可能是VSMC增殖的促進(jìn)因子,KLF4是VSMC分化的促進(jìn)因子,KLF4通過拮抗KLF5的促增殖作用來發(fā)揮其誘導(dǎo)VSMC分化的作用。 結(jié)論 1 ATRA通過誘導(dǎo)VSMC分化標(biāo)志基因SM22α和α-SMA表達(dá)、抑制去分化標(biāo)志基因SMemb表達(dá)而促進(jìn)VSMC從去分化型向分化型轉(zhuǎn)化,表現(xiàn)為VSMC增殖和遷移活性降低,對(duì)乙酰膽堿刺激的收縮反應(yīng)性增強(qiáng)。 2在KLF4促進(jìn)VSMC分化標(biāo)志基因表達(dá)的同時(shí)也抑制去分化標(biāo)志基因的表達(dá)。KLF4在ATRA誘導(dǎo)VSMC分化中發(fā)揮重要作用。 3 ATRA對(duì)VSMC遷移活性的抑制作用與誘導(dǎo)KLF4表達(dá)并進(jìn)而抑制MMP-2和MMP-9的表達(dá)及活性有關(guān)。 4 ATRA可以有效地抑制VSMC增殖,使其停滯于G1期,此作用可能通過多種途徑實(shí)現(xiàn),其中,誘導(dǎo)KLF4表達(dá)及由此引起的P53表達(dá)上調(diào)和CDK4表達(dá)下調(diào)是其重要機(jī)制。 5 KLF5對(duì)VSMC具有促增殖作用,KLF4具有拮抗KLF5的作用,并通過誘導(dǎo)分化標(biāo)志基因表達(dá)而促進(jìn)VSMC分化。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號(hào)】：R341

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本文編號(hào)：1428909