本文關(guān)鍵詞：新型熒光衍生法測定細(xì)胞凋亡關(guān)鍵酶活性　出處：《復(fù)旦大學(xué)》2010年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：細(xì)胞凋亡是細(xì)胞的一種基本生物學(xué)現(xiàn)象,在多細(xì)胞生物去除不需要的或異常的細(xì)胞中起著必要的作用。它在生物體的進(jìn)化、內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定以及多個(gè)系統(tǒng)的發(fā)育中起著重要的作用。盡管凋亡過程的詳細(xì)機(jī)制尚不完全清楚,但是已經(jīng)確定Caspase即半胱天冬蛋白酶在凋亡過程中是起著必不可少的作用,細(xì)胞凋亡的過程實(shí)際上是Caspase不可逆有限水解底物的級(jí)聯(lián)放大反應(yīng)過程,到目前為止,至少已有14種Caspase被發(fā)現(xiàn),Caspase分子間的同源性很高,結(jié)構(gòu)相似,都是半胱氨酸家族蛋白酶。 Caspase酶是細(xì)胞凋亡關(guān)鍵酶,因此其活性檢測就成為判斷細(xì)胞凋亡程度的重要標(biāo)準(zhǔn)。最近,我們課題組發(fā)現(xiàn)多肽能夠與兒茶酚和高碘酸鈉在pH7.5進(jìn)行縮合反應(yīng),形成單一的熒光產(chǎn)物,激發(fā)最大波長在390nm附近,發(fā)射波長在490nm左右。更為重要的是,自由氨基酸、葡萄糖和半乳糖等糖類化合物、精胺等多胺化合物以及DNA堿基如腺嘌呤、鳥嘌呤、胸腺嘧啶和胞嘧啶等相同反應(yīng)條件下均不產(chǎn)生熒光。因此,新型熒光衍生方法檢測caspase酶的活性專屬性強(qiáng),操作簡便,利于推廣,具有一定的應(yīng)用前景。 課題第一部分首先對寡肽熒光衍生條件進(jìn)行了優(yōu)化,在此基礎(chǔ)上再對高效液相分析條件進(jìn)行了優(yōu)化。優(yōu)化后的熒光衍生體系為：供試液100μL,兒茶酚(10mmol/L) 100μL,高碘酸鈉(12 mmol/L)50μL,硼酸(300 mmol/L,pH 7.0)50μL,加熱溫度120℃,加熱時(shí)間10 min。優(yōu)化后的色譜條件為：色譜柱：CAPCELL PAK C18 MGS5 (5 u m,150 mm X 4.6 mm I.D.);流動(dòng)相：A(250 mmol/L硼酸,氫氧化鈉調(diào)pH值到7.5,20%)：B(水,80-0%)：C(甲醇,0-80%)(v/v/v),梯度時(shí)間40 min；流速為1.0 mL/min;柱溫：30℃；熒光檢測波長：激發(fā)波長390 nm,發(fā)射波長490 nm；進(jìn)樣量：20μL 課題第二部分用新型熒光衍生方法測定亮氨酸腦啡肽并與紫外檢測方法、OPA衍生法進(jìn)行了比較。亮氨酸腦啡肽是一種非常重要的內(nèi)源肽,其氨基酸順序和結(jié)構(gòu)為：酪氨酸-甘氨酸-甘氨酸-苯丙氨酸-亮氨酸Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu)。體外試驗(yàn)中,保留時(shí)間為25min,線性范圍為0.5～50.0 mg/L(r=0.9999),最低定量限為0.25 mg/L；模擬血漿實(shí)驗(yàn)中,內(nèi)源物質(zhì)不干擾測定,線性范圍為0.5～50.0mg/L(r=0.9998),最低定量限為0.5 mg/L。血漿中內(nèi)源性干擾物質(zhì)多,紫外檢測方法和OPA衍生法都不能有效檢測亮氨酸腦啡肽的含量。 課題第三部分是本課題重點(diǎn),利用新型熒光衍生方法來檢測兩種細(xì)胞系人宮頸癌細(xì)胞(Hela細(xì)胞)和人肺腺癌細(xì)胞(A549細(xì)胞)受誘導(dǎo)凋亡后的caspase-3和caspase-8的活性。每種細(xì)胞系均采用三種誘導(dǎo)凋亡方法：低溫輔助紫外照射誘導(dǎo)凋亡,絲裂霉素C誘導(dǎo)凋亡和喜樹堿誘導(dǎo)凋亡。Caspase酶底物設(shè)計(jì)為在特異識(shí)別序列N端加上具有親水性氨基酸絲氨酸,這可以增加底物水溶性,N端延長序列同時(shí)能增加底物專屬性,C端加上實(shí)驗(yàn)證明衍生效率較高的兩種寡肽片段LG和ALG。本部分采用市場上常用的caspase-3,8活性檢測試劑盒作為新型熒光衍生方法的對照,結(jié)果表明,兩種方法的活性檢測相似(r=0.9556,P0.01),表明新方法具有可靠性,同時(shí),重組caspase酶實(shí)驗(yàn)表明新方法具有更好的專屬性,因此新型熒光衍生方法可以作為檢測caspase酶活性的可靠方法。
[Abstract]:Apoptosis is a basic biological phenomenon of cells, plays a necessary role in multicellular organisms to remove unwanted or abnormal cells. It is in the evolution of organisms, plays an important role in the stability of the environment and the development of multiple systems. Although apoptosis detailed mechanism still is not entirely clear. But Caspase has been confirmed that caspase in the apoptotic process is play an essential role, the process of apoptosis is irreversible proteolytic cascade Caspase co amplification reaction process, so far, has at least 14 Caspase was found between Caspase molecules have high homology and similar structure, all cysteine proteases.
Caspase was a key enzyme of apoptosis, therefore its activity detection has become an important standard to judge the extent of apoptosis. Recently, our research group found that peptides can condensation reaction with catechol and sodium periodate in pH7.5, forming a fluorescent single product, stimulate the maximum wavelength in the vicinity of 390nm, the emission wavelength at about 490nm more. It is important that the free amino acid, glucose and galactose in carbohydrate, spermine and polyamine compounds such as DNA bases adenine, guanine, thymine and cytosine etc. under the same reaction conditions had no fluorescence. Therefore, a new fluorescence derivatization method for detection of caspase enzyme activity of strong specificity, simple operation, conducive to the promotion. It has a certain application prospect.
The first part of the paper oligopeptide fluorescence derivatization conditions were optimized based on the HPLC analysis conditions were optimized. The optimized system for fluorescent derivative: test solution 100 L, catechol (10mmol/L) 100 L, sodium periodate (12 mmol/L) 50 L, boric acid (300 mmol/L, 7 pH) 50 L, heating temperature of 120 DEG C, heating time 10 min. chromatographic conditions were optimized: the chromatographic column: CAPCELL PAK C18 MGS5 (5 u m, 150 mm X 4.6 mm I.D.); mobile phase: A (250 mmol/L boric acid, sodium hydroxide to adjust the pH value to 7.5,20%:B) (water, 80-0%):C (methanol, 0-80%) (v/v/v), gradient time 40 min; the flow rate was 1 mL/min; column temperature: 30 C; fluorescence detection wavelength: excitation wavelength 390 nm, emission wavelength of 490 nm; sample size: 20 L
The second part of the study with new fluorescence derivatization method for the determination of leucine enkephalin and detected with UV method, compares the OPA derivative method. Leucine enkephalin is an important endogenous peptide, amino acid sequence and structure: Tyr Gly Gly phe - leucine Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu). In vitro, retention time is 25min, the linear range was 0.5 ~ 50 mg/L (r=0.9999), the lowest detection limit of 0.25 mg/L; plasma simulation experiment, endogenous substances did not interfere with the determination, the linear range of 0.5 ~ 50.0mg/L (r=0.9998), the lower limit of quantification was 0.5 mg/L. in plasma endogenous interference substances, the content of UV detection method and OPA derivative method is not effective in detecting leucine enkephalin.
The third part is the emphases of this paper, the derivative method to detect two cell lines of human cervical cancer cells by using fluorescent (Hela cells) and human lung adenocarcinoma cells (A549 cells) induced by apoptosis after caspase-3 and caspase-8. The activity of each cell line were used three methods: apoptosis induced by hypothermia apoptosis UV irradiation induced apoptosis induced by mitomycin C, and camptothecin induced apoptosis of.Caspase enzyme substrate is designed with hydrophilic amino acid serine in the specific recognition sequence of N terminal, which can increase the water solubility of the substrate, N can also increase the end of an extended sequence of substrate specificity, were added to C - the results show that the two widow LG ALG. derived peptide fragments and high efficiency by adopting the market commonly used caspase-3,8 activity detection kit as a new fluorescence derivatization method. The results show that the two methods have similar activity (r= 0.9556, P0.01) It indicates that the new method is reliable. Meanwhile, the recombinant caspase enzyme experiment shows that the new method has better specificity. Therefore, the new fluorescence derivatization method can be used as a reliable method to detect caspase enzyme activity.

【學(xué)位授予單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號(hào)】：R329

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本文編號(hào)：1428824