發(fā)布時間：2018-01-14 21:21

  本文關(guān)鍵詞：新生隱球菌格魯比變種毒力差異基因型菌株之間毒力相關(guān)基因的分析研究　出處：《貴陽醫(yī)學(xué)院》2014年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

  更多相關(guān)文章： 新生隱球菌 毒力基因 全基因組重測序 基因敲除

【摘要】：目的了解新生隱球菌格魯比變種(Cryptococcus neoformans var. grubii.)兩組毒力差異明顯的多位點(diǎn)微衛(wèi)星型(Multilocus Microsatellite Typing, MLMT)菌株間的差異基因,探討導(dǎo)致新生隱球菌格魯比變種間毒力差異的相關(guān)基因及這些基因的功能。方法1、采用多位點(diǎn)序列分型(Multilocus Sequence Typing, MLST)技術(shù)分析分離自環(huán)境和臨床各10株新生隱球菌格魯比變種的基因型,并鑒定實(shí)驗(yàn)菌株交配型,與之前實(shí)驗(yàn)中的微衛(wèi)星分型結(jié)果對比,比較不同基因分型方法的分類多樣性。2、根據(jù)已有基因組數(shù)據(jù),針對可能為新生隱球菌毒力相關(guān)的基因設(shè)計(jì)特異性引物,擴(kuò)增并測序,通過序列對比分析每個基因在兩組微衛(wèi)星基因型菌株間存在的單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms, SNPs)位點(diǎn),并對引起差異的蛋白質(zhì)進(jìn)行分析和預(yù)測。3、選取毒力差異最為明顯的不同基因型菌株各一株進(jìn)行全基因組重測序,運(yùn)用比較基因組學(xué)方法全面分析測序結(jié)果,使用非同義SNPs(non-synonymous SNPs, nsSNPs)、無義突變SNPs、產(chǎn)生移碼突變InDels勺策略廣泛篩選差異基因。4、對篩選出的基因在所有實(shí)驗(yàn)菌株中進(jìn)行DNA測序驗(yàn)證,并提取總RNA,采用快速擴(kuò)增5’和3’cDNA末端(rapid amplification of 5'and 3'cDNA ends, RACE)技術(shù),克隆后測序獲得對應(yīng)基因的完整cDNA全長序列信息。5、通過重組PCR技術(shù)構(gòu)建帶有諾爾絲菌素抗性標(biāo)記(nourseothricin-resistant marker, NAT)基因和目的基因側(cè)翼序列的基因敲除盒,利用基因槍直接轉(zhuǎn)化新生隱球菌原始株,篩選和驗(yàn)證獲得CNAG_01032基因敲除菌株；從原始株的基因組中擴(kuò)增CNAG_01032基因及兩側(cè)翼共約5.4kb序列,分別酶切后與將帶有抗性標(biāo)記基因NEO的質(zhì)粒連接,得到pJAF12-01032重組質(zhì)粒,利用基因槍將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化敲除株,經(jīng)篩選和驗(yàn)證獲得CNAG_01032基因重建株。結(jié)果1、在微衛(wèi)星分型中為MLMT-36的10株環(huán)境分離株,MLST分型為ST-15,而在微衛(wèi)星分型中為MLMT-13型的10株臨床分離株,MLST分型為ST-32,所有菌株交配型均為MATα;2、在成功測序的11個基因中,除2個基因序列完全相同外,其余9個基因在兩組毒力差異明顯的基因型菌株間分別存在1-4個規(guī)律性SNP,其中,有2個基因中存在nsSNPs,這2個基因的編碼產(chǎn)物分別為沉默信息調(diào)節(jié)因子2家族成員Hst302和UV切除修復(fù)蛋白Rad23。另外,在對Rad23蛋白的系統(tǒng)發(fā)育分析發(fā)現(xiàn),與真菌界的其他門類相比,在擔(dān)子菌綱的多數(shù)Rad23蛋白與人類的同源基因親緣關(guān)系更近。3、通過全基因組重測序,環(huán)境株IFM56731和臨床株IFM56800均分別獲得覆蓋率較高的有效數(shù)據(jù)。分別對SNPs和InDels數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,應(yīng)用無義突變SNPs和產(chǎn)生移碼突變的InDel分別篩選出3個差異基因。4、對篩選出的6個基因在所有實(shí)驗(yàn)菌株中進(jìn)行擴(kuò)增測序,并對其中3個基因進(jìn)行cDNA的測序分析,最終確定基因CNAG_01032的轉(zhuǎn)錄序列位置和結(jié)構(gòu),并驗(yàn)證了預(yù)測的無義突變位點(diǎn)存在于實(shí)際的mRNA中。5、通過測序證明24個抗諾爾斯菌素陽性轉(zhuǎn)化子中有20個已成功敲除基因CNAG_01032,設(shè)定其中1號轉(zhuǎn)化子為CNAG_01032基因缺陷株；通過三組PCR擴(kuò)增和四組含抗生素培養(yǎng)基的綜合篩選,獲得成功整合表達(dá)載體并穩(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)化子3個,設(shè)定3號轉(zhuǎn)化子為CNAG_01032基因重建株。結(jié)論1、MLST分型結(jié)果與前期實(shí)驗(yàn)的MLMT分型結(jié)果高度一致,提示以上兩種分子分型技術(shù)在真菌分類鑒定研究中可顯示對于其分離背景及進(jìn)化來源的高分辨率及穩(wěn)定性。2、通過測序分析,篩選出兩個具有重要功能的差異基因(RAD23和HST302),且差異位點(diǎn)氨基酸改變對蛋白結(jié)構(gòu)和功能具有一定影響,推測基因RAD23和HST302為引起不同基因型菌株間毒力差異的相關(guān)基因。3、通過全基因重測序數(shù)據(jù)分析證明,應(yīng)用無義突變SNPs和產(chǎn)生移碼突變的InDel進(jìn)行差異基因篩選的策略具有較好針對性,并篩選出6個潛在與毒力相關(guān)的基因。4、通過對所有實(shí)驗(yàn)菌株的測序和對全長cDNA的測序驗(yàn)證,最終篩選出基因CNAG_01032為可能引起菌株毒力差異的基因。5、成功構(gòu)建新生隱球菌CNAG_01032基因的缺陷株和重建株,為后續(xù)探明基因功能奠定基礎(chǔ)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：貴陽醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R379.5

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 康穎倩;趙亮;王梅竹;張金娟;賀娟;陳玉如;王丹霓;朱鍵;三上襄;;新生隱球菌格魯比變種臨床株與環(huán)境株微衛(wèi)星基因型的小鼠毒力實(shí)驗(yàn)研究[J];中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志;2011年07期

2 張園;王靜梅;剡根強(qiáng);;新生隱球菌病研究進(jìn)展[J];動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展;2007年12期

，

本文編號：1425360