本文關(guān)鍵詞：問(wèn)號(hào)鉤端螺旋體鞭毛相關(guān)fliN基因靶向敲除及其突變株致病性變化　出處：《浙江大學(xué)》2010年碩士論文　論文類(lèi)型：學(xué)位論文

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【摘要】： 背景和目的問(wèn)號(hào)鉤端螺旋體(簡(jiǎn)稱(chēng)鉤體)感染引起的鉤體病是全球流行的自然疫源性人獸共患傳染病,其致病機(jī)制至今不明。研究結(jié)果顯示,不同毒力的問(wèn)號(hào)鉤體均能以菌體一端或兩端粘附宿主細(xì)胞,而此處正是相當(dāng)于細(xì)菌鞭毛基礎(chǔ)小體的鉤體鞭毛終結(jié)結(jié)構(gòu)所在部位。細(xì)菌鞭毛基礎(chǔ)小體含有Ⅲ型分泌系統(tǒng),不僅承擔(dān)細(xì)菌分裂后鞭毛生長(zhǎng)時(shí)鞭毛蛋白的輸出,一些與細(xì)菌粘附、侵襲和毒性相關(guān)因子也通過(guò)T3SS釋放。問(wèn)號(hào)鉤體fliN基因雖被注釋為鞭毛馬達(dá)開(kāi)關(guān)蛋白,但其序列中有與大腸桿菌fliN基因、鼠疫耶爾森菌yscQ基因相似的共同基序Pf:SpoA。大腸桿菌fliN基因?qū)儆赥3SS,其產(chǎn)物在細(xì)菌粘附及侵入細(xì)胞過(guò)程中有重要作用。YscQ也是耶爾森菌T3SS中與侵襲力相關(guān)的毒力蛋白。因此,問(wèn)號(hào)鉤體fliN也極有可能具有與大腸桿菌fliN和耶爾森菌YscQ相似的功能。本研究中,我們采用基因敲除技術(shù)構(gòu)建了fliN基因失活的問(wèn)號(hào)鉤體突變株,通過(guò)比較野生株和突變株動(dòng)力以及分泌毒性物質(zhì)、黏附細(xì)胞、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡能力的差異,對(duì)問(wèn)號(hào)鉤體fliN基因的致病機(jī)制進(jìn)行了研究。 實(shí)驗(yàn)方法構(gòu)建基因打靶載體p2NIL~(fliN-amp),采用基于自殺質(zhì)粒與染色體同源序列重組的靶基因敲除技術(shù)構(gòu)建不表達(dá)fliN的問(wèn)號(hào)鉤體賴(lài)型56601株突變株,采用PCR、測(cè)序和Western Blot對(duì)fliN~-突變株進(jìn)行鑒定。采用動(dòng)力試驗(yàn)、MTT、Fontana鍍銀染色法和流式細(xì)胞術(shù),對(duì)fliN~-突變株的遷移能力、培養(yǎng)物上清對(duì)小鼠單核-巨噬樣細(xì)胞株J774A.1的細(xì)胞毒性、黏附及誘導(dǎo)J774A.1細(xì)胞凋亡能力的改變進(jìn)行研究。 結(jié)果PCR、測(cè)序和Western blot結(jié)果均證實(shí)成功構(gòu)建了fliN~-突變株,該突變株能在含100μg/ml氨芐青霉素的Korthof培養(yǎng)基中生長(zhǎng)及繁殖。fliN~-突變株在Korthof半固體培養(yǎng)基上菌落直徑(2～3 mm)明顯小于野生株(6～8 mn),表明該突變株動(dòng)力消失。fliN~-突變株培養(yǎng)物上清作用J774A.1細(xì)胞72 h時(shí)雖顯示有細(xì)胞毒性,但明顯低于野生株(P＜0.05)。fliN~-突變株作用J774A.1細(xì)胞60 min時(shí)的黏附率(25.5%)明顯低于野生株(47.5%),其引起J774A.1細(xì)胞壞死和細(xì)胞凋亡率(30.6%和22.7%)也明顯低于野生株(48.2%和35.2%)(P＜0.05)。 結(jié)論fliN~-基因產(chǎn)物與問(wèn)號(hào)鉤體黏附細(xì)胞、分泌毒力因子和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡密切相關(guān)。采用基于自殺質(zhì)�；蚯贸夹g(shù)可用于研究問(wèn)號(hào)鉤體靶基因產(chǎn)物的致病機(jī)制。
[Abstract]:Background and objective Leptospirosis caused by Leptospira interrogans (Leptospira) infection is a worldwide epidemic of zoonotic infectious diseases, and its pathogenesis is still unknown. Leptospira with different virulence could adhere to host cells at one or both ends of the cell. This is where the Leptospiral flagellum terminates corresponding to the bacterial flagellum basal body. The bacterial flagellum basal body contains type 鈪，

本文編號(hào)：1424010