本文關(guān)鍵詞：MLCK鈣調(diào)蛋白結(jié)合位點(diǎn)突變體的構(gòu)建及其對(duì)VSMC增殖和遷移的影響　出處：《大連醫(yī)科大學(xué)》2014年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：目的：平滑肌在體內(nèi)分布廣泛，其具有多種獨(dú)特的功能和復(fù)雜的調(diào)節(jié)機(jī)制，對(duì)維持人體生理功能起重要的調(diào)節(jié)作用。肌球蛋白輕鏈激酶（myosin light chainkianse, MLCK）是調(diào)節(jié)平滑肌收縮的關(guān)鍵酶。一般情況下，當(dāng)平滑肌細(xì)胞受到刺激后，細(xì)胞內(nèi)的Ca2+濃度升高并達(dá)到閾值，Ca2+和鈣調(diào)蛋白（calmodulin, CaM）結(jié)合形成Ca2+/CaM復(fù)合物，該復(fù)合物可以激活MLCK，活化的MLCK可以使肌球蛋白20kDa調(diào)節(jié)輕鏈（myosin light chains，MLC20）的第19位絲氨酸磷酸化，進(jìn)而激活肌球蛋白頭部的Mg2+-ATP酶的活性，ATP水解釋放能量，促使肌球蛋白與肌動(dòng)蛋白之間發(fā)生相互作用，引起平滑肌的收縮，這是平滑肌收縮的激酶調(diào)節(jié)機(jī)制。MLCK作為一種多功能調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)，，除具有激酶活性外，還具有與肌動(dòng)蛋白和肌球蛋白結(jié)合的非激酶活性。研究表明，MLCK對(duì)細(xì)胞增殖、遷移以及細(xì)胞骨架的重組也有重要的作用。在生理?xiàng)l件下，平滑肌細(xì)胞在Ca2+濃度下降后仍維持一定程度張力，表明MLCK的非激酶作用可能在平滑肌收縮與舒張的調(diào)節(jié)過(guò)程中產(chǎn)生一定影響。以往的體外功能研究顯示：當(dāng)MLCK的第1002-1022位CaM結(jié)合位點(diǎn)突變后，MLCK失去了磷酸化MLC20的激酶活性；并且它可以在無(wú)Ca2+/CaM條件下降低磷酸化肌球蛋白的Mg2+-ATP酶活性，增加非磷酸化肌球蛋白的Mg2+-ATP酶活性；同時(shí)它也可以降低體外肌動(dòng)蛋白肌絲運(yùn)動(dòng)的速度。為了更好地研究MLCK分子的非激酶活性對(duì)血管平滑肌細(xì)胞增殖和遷移的影響，本實(shí)驗(yàn)擬構(gòu)建MLCK的CaM結(jié)合位點(diǎn)突變真核表達(dá)載體。利用牛胃重組全長(zhǎng)野生型MLCK，對(duì)其第1002-1022位氨基酸（即CaM結(jié)合位點(diǎn)）進(jìn)行定點(diǎn)突變。本實(shí)驗(yàn)在牛胃平滑肌MLCK的1002-1022CaM結(jié)合位點(diǎn)Trp1006突變?yōu)锳la的基礎(chǔ)上進(jìn)行突變，使MLCK的1002-1022CaM結(jié)合位點(diǎn)中Arg1018突變?yōu)锳la（即AGA突變?yōu)镚CG）、Leu1019突變?yōu)锳la（即CTG中的CT突變?yōu)镚C），從而構(gòu)建了牛胃MLCK的1002-1022CaM結(jié)合位點(diǎn)突變的真核表達(dá)載體（pcDNA3.1-Flag-MLCK-Δ3CaM）。為了研究MLCK的非激酶活性對(duì)血管平滑肌細(xì)胞增殖和遷移的影響，將構(gòu)建的MLCK的1002-1022CaM結(jié)合位點(diǎn)突變真核表達(dá)載體（pcDNA3.1-Flag-MLCK-Δ3CaM）轉(zhuǎn)染至MLCK基因缺失的豚鼠腦基底動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞（Gba M-），對(duì)比轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞增殖和遷移的變化。本實(shí)驗(yàn)在以往研究的基礎(chǔ)上，為探索MLCK的非激酶活性對(duì)平滑肌細(xì)胞功能的影響，進(jìn)一步闡明平滑肌收縮的機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法：⑴根據(jù)牛胃MLCK cDNA序列設(shè)計(jì)CaM結(jié)合位點(diǎn)突變引物，利用PCR技術(shù)進(jìn)行定點(diǎn)突變，構(gòu)建CaM結(jié)合位點(diǎn)突變的原核表達(dá)載體（pColdⅠ-MLCK-Δ3CaM）和真核表達(dá)載體（pcDNA3.1-Flag-MLCK-Δ3CaM）。⑵將pcDNA3.1-Flag-MLCK-Δ3CaM轉(zhuǎn)染至Gba M-細(xì)胞，用免疫熒光法檢測(cè)質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染情況。⑶用合適濃度的G418篩選pcDNA3.1-Flag-MLCK-Δ3CaM穩(wěn)定轉(zhuǎn)染至Gba M-的細(xì)胞株。⑷用MTT法檢測(cè)pcDNA3.1-Flag-MLCK-Δ3CaM轉(zhuǎn)染至Gba M-后細(xì)胞增殖情況。⑸用劃痕法檢測(cè)pcDNA3.1-Flag-MLCK-Δ3CaM轉(zhuǎn)染至Gba M-后細(xì)胞遷移情況。 結(jié)果：⑴針對(duì)CaM結(jié)合位點(diǎn)設(shè)計(jì)突變引物，以pColdⅠ-MLCK-Δ1CaM為模板進(jìn)行PCR，用NcoⅠ單酶切pColdⅠ-MLCK-Δ1CaM質(zhì)粒和pColdⅠ-MLCK質(zhì)粒，分別從pColdⅠ-MLCK-Δ1CaM獲得556bp突變的目的片段，從pColdⅠ-MLCK獲得7.4kb的載體片段，用連接酶將556bp突變目的片段和7.4kb載體片段連接，獲得CaM結(jié)合位點(diǎn)三點(diǎn)突變的原核表達(dá)載體pColdⅠ-MLCK-Δ3CaM，該質(zhì)粒經(jīng)測(cè)序結(jié)果正確。⑵用KpnⅠ和EcoRⅠ雙酶切pColdⅠ-MLCK-Δ3CaM質(zhì)粒pcDNA3.1-Flag-MLCK真核表達(dá)質(zhì)粒，分別從pColdⅠ-MLCK-Δ3CaM獲得3.4kb目的片段，從pcDNA3.1-Flag-MLCK獲得5.5kb的載體片段，用連接酶將3.4kb目的片段和5.5kb的載體片段連接獲得CaM結(jié)合位點(diǎn)三點(diǎn)突變的真核表達(dá)載體pcDNA3.1-Flag-MLCK-Δ3CaM，該質(zhì)粒經(jīng)測(cè)序結(jié)果正確。⑶用免疫熒光法檢測(cè)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染情況，將pcDNA3.1-Flag-MLCK-Δ3CaM轉(zhuǎn)染至Gba M-細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染48小時(shí)后的Gba M-細(xì)胞充分表達(dá)MLCK蛋白，轉(zhuǎn)染效率約達(dá)80%。⑷利用G418篩選質(zhì)粒pcDNA3.1-Flag-MLCK-Δ3CaM穩(wěn)定轉(zhuǎn)染至Gba M-的細(xì)胞株，確定了G418對(duì)血管平滑肌細(xì)胞MLCK基因缺失型Gba SM-4的藥物最低致死濃度為500ug/ml。⑸用MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況，結(jié)果顯示：與Gba SM-4細(xì)胞（未敲除MLCK）組相比，Gba M-（MLCK敲除）組細(xì)胞增殖率明顯升高；而分別將pcDNA3.1-Flag-MLCK和pcDNA3.1-Flag-MLCK-Δ3CaM轉(zhuǎn)染到Gba M-后細(xì)胞增殖率均明顯降低，但二者未見(jiàn)顯著差異（p0.05）。⑹用劃痕法檢測(cè)細(xì)胞遷移，結(jié)果顯示：與Gba SM-4組相比，Gba M-組細(xì)胞遷移率降低，而分別轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-Flag-MLCK和轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-Flag-MLCK-Δ3CaM到GbaM-后細(xì)胞遷移率均升高,但二者未見(jiàn)明顯差異（p0.05）。 結(jié)論：⑴成功的構(gòu)建了MLCK的CaM結(jié)合位點(diǎn)突變?cè)吮磉_(dá)載體（pColdⅠ-MLCK-Δ3CaM）和真核表達(dá)載體（pcDNA3.1-Flag-MLCK-Δ3CaM）。⑵在血管平滑肌細(xì)胞GbaSM-4中MLCK具有抑制細(xì)胞增殖的作用，其中MLCK的1002-1022CaM結(jié)合位點(diǎn)對(duì)細(xì)胞增殖的作用不明顯。⑶在血管平滑肌細(xì)胞GbaSM-4中MLCK能夠促進(jìn)細(xì)胞遷移，其中MLCK的1002-1022CaM結(jié)合位點(diǎn)對(duì)細(xì)胞遷移的作用不明顯。
[Abstract]:In order to study the effect of MLCK on proliferation and migration of smooth muscle cells , the activity of myosin light chain kinase ( MLCK ) and the activity of myosin light chain kinase ( MLCK ) on the proliferation and migration of smooth muscle cells were studied . Methods : ( 1 ) The eukaryotic expression vector ( pCold 鈪

本文編號(hào)：1417968