本文關(guān)鍵詞：抗生殖支原體MgPa’重組蛋白單克隆抗體的制備及鑒定　出處：《南華大學》2008年碩士論文　論文類型：學位論文

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【摘要】： 目的:將本試驗室構(gòu)建的含生殖支原體黏附素(Mycoplasma genitalium adhesin protein ,MgPa)蛋白優(yōu)勢表位基因(MgPa’3 223～4 092bp)的重組表達載體pET-30a(+)/MgPa’在表達宿主菌E.coliRosettaTM2(DE3)中進行誘導表達,純化表達產(chǎn)物并進行抗原性分析。應用雜交瘤技術(shù),將SP2/0細胞與經(jīng)重組蛋白MgPa’免疫的小鼠脾細胞進行融合,篩選抗重組蛋白MgPa’的單克隆抗體(mAb),并進行鑒定和純化。由此初步確定該mAb的應用價值,并為研制Mg感染診斷試劑盒奠定基礎(chǔ)。 方法:(1)采用鎳親和層析法純化重組蛋白MgPa’,并用SDS-PAGE分析和Western-blot鑒定表達產(chǎn)物。(2)以純化復性后的MgPa’重組蛋白免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠的脾細胞與SP2/0細胞融合,用間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)篩選分泌特異性抗體的雜交瘤細胞。(3)體內(nèi)誘生腹水法制備抗體,ELISA法檢測抗體效價,采用競爭法ELISA和Western-blot分析mAb的特異性,用mAb亞類測定試劑盒鑒定mAb的類別,用硫酸銨沉淀法對腹水中的mAb進行純化。 結(jié)果:重組目的基因表達菌在IPTG的誘導下,表達了相對分子量(Mr)約為37kDa的目的蛋白,目的蛋白在菌體內(nèi)主要以包涵體形式存在;經(jīng)Ni-NTA親和層析法純化獲得了純度在95%以上的重組蛋白;應用純化復性后的重組蛋白MgPa’免疫6～8周齡的BALB/c小鼠,采用雜交瘤技術(shù)進行細胞融合;應用ELISA法篩選出了6株分泌抗MgPa’重組蛋白mAb的雜交瘤細胞株,分別命名為12E7、4B1、6E3、2B8、6E2和10E2;競爭法ELISA或Western-blot分析結(jié)果顯示mAb均能與重組蛋白MgPa’很好的結(jié)合。用腹水誘生法大量制備mAb;ELISA檢測6株雜交瘤細胞誘生腹水中的mAb效價分別為1:25 600、1:25 600、1:12 800、1:25 600、1:25 600和1:25 600;經(jīng)Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Kit測定,6株雜交瘤細胞中12E7、4B1分泌的mAb為IgG2b,其它4株分泌的mAb均為IgG1。 結(jié)論: (1)篩選出6株穩(wěn)定分泌抗MgPa’mAb的雜交瘤細胞株,經(jīng)鑒定6株雜交瘤細胞分泌的mAb均能識別重組MgPa’。 (2)獲得的抗重組MgPa’的mAb均為IgG類抗體,且能識別MgPa’抗原的天然表位,具有較好的特異性。
[Abstract]:Objective: the laboratory construct containing the adhesin of Mycoplasma genitalium (Mycoplasma genitalium adhesin protein, MgPa) protein epitope gene (MgPa 3223~4 092bp) recombinant expression vector pET-30a (+) /MgPa expression in E.coli E.coliRosettaTM2 (DE3) in the expression, purification and antigenicity analysis. The application of hybridoma technology, SP2/0 cells and the recombinant protein MgPa of immunized mice spleen cells were fused, screening monoclonal antibodies against recombinant protein MgPa '(mAb), was identified and purified. The first step to determine the application value of the mAb, and lay the foundation for the development of Mg infection diagnosis kit.
Methods: (1) using nickel affinity chromatography purification of recombinant protein MgPa, and analyzed by SDS-PAGE and Western-blot (2). The expressed product was identified by purification of refolded MgPa recombinant protein immunized BALB/c mice splenocytes from the immunized mice were fused with SP2/0 cells, using indirect enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) screening hybridoma cells secreting specific antibodies. (3) in ascites were induced to produce the antibody titers of ELISA method, the specific competition law ELISA and Western-blot analysis of mAb, mAb sub category determination kit for identification of mAb, of mAb in ascites were purified by ammonium sulfate precipitation method.
Results: the recombinant gene expression was induced by IPTG. The expression of the relative molecular weight of about 37kDa (Mr) protein, the protein in the bacteria mainly existed in the form of inclusion body; by Ni-NTA affinity chromatography. The purity of the recombinant protein was above 95%; should be purified after refolding of recombinant protein MgPa 'immune 6 ~ 8 week old BALB/c mice were fused by hybridoma technique; ELISA method was used to isolate 6 strains of hybridoma cell strains secreting anti MgPa recombinant protein mAb, named 12E7,4B1,6E3,2B8,6E2 and 10E2; competition law ELISA or Western-blot analysis showed that mAb can MgPa with recombinant protein good combination. The preparation of mAb ascites by induction; ELISA detection of 6 strains of hybridoma cells induced mAb titer in ascites were 1:25 600,1:25 600,1:12 800,1:25 600,1:25 600 and 1:25 600; Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Kit determined that the mAb of 12E7,4B1 secreted in 6 hybridoma cells was IgG2b, and the other 4 secreted mAb were IgG1..
Conclusion:
(1) 6 hybridoma cells with stable secretion of anti MgPa 'mAb were screened, and the mAb secreted by 6 hybridoma cells could identify the recombinant MgPa'.
(2) the mAb anti recombinant MgPa 'is IgG antibody, and it can identify the natural epitopes of MgPa' antigen, which has good specificity.

【學位授予單位】：南華大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2008
【分類號】：R392.1

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本文編號：1417910