本文關(guān)鍵詞：抗2型登革病毒M蛋白和NS1蛋白單克隆抗體的制備及鑒定　出處：《重慶醫(yī)科大學(xué)》2008年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】： 目的:近年來,登革病毒(DV)在世界許多國家和地區(qū),尤其是東南亞流行趨勢加重,已成為全球嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題。由于目前尚無有效預(yù)防登革病毒感染的疫苗上市,而登革出血熱和登革熱休克綜合征的死亡率較高,因此早期快速準(zhǔn)確的診斷登革病毒感染就顯得尤為重要。目前新問市的登革病毒感染診斷試劑主要是以全病毒或重組E蛋白為檢測抗原,其特異性和靈敏性有待進(jìn)一步深入研究。 本研究擬利用2型登革病毒New Guinea C株(NGC株)重組質(zhì)�？寺”磉_(dá)重組M蛋白和NS1蛋白,制備抗2型登革病毒M蛋白和NS1蛋白的單克隆抗體,并對其生物學(xué)特性進(jìn)行了鑒定,為下一步制備快速檢測登革病毒感染的膠體金試紙條奠定基礎(chǔ)。 方法:誘導(dǎo)表達(dá)含DV2 prm、ns1基因的原核表達(dá)重組載體pET-32a(+)/prM、pET-32a(+)/M、pQE-30/NS1,并且采用了Ni~(2+)-NTA樹脂親和層析純化重組蛋白,以SDS-PAGE進(jìn)行初步鑒定,并以兔抗登革病毒免疫血清鑒定其免疫活性。以重組蛋白免疫Balb/c小鼠,采用雜交瘤技術(shù)制備抗登革病毒重組蛋白的McAb,采用間接ELISA方法和Western blot進(jìn)行McAb特異性鑒定;同時(shí)采用間接ELISA方法鑒定McAb的Ig亞類、效價(jià)及親和力進(jìn)行分析。 結(jié)果:重組蛋白pET-32a(+)/M、pQE-30/NS1以上清和包涵體表達(dá),用兔抗登革病毒血清檢測發(fā)現(xiàn)上清中蛋白抗原活性強(qiáng)。利用Ni~(2+)-NTA樹脂親和層析方法,從上清中純化蛋白獲得成功。 通過雜交瘤技術(shù)成功獲得3株可分泌特異性McAb的雜交瘤細(xì)胞Ⅲ1A6,Ⅲ3D2和Ⅲ4C3。其中Ⅲ1A6,Ⅲ4C3的抗體亞類均為IgG1;Ⅲ3D2的抗體亞類為IgG2a。細(xì)胞培養(yǎng)上清的效價(jià)分別為1:10~6 , 1:10~5和1:10~6;3株單抗的親和常數(shù)均在10~7以上。Western bolt檢測證明3株雜交瘤細(xì)胞所分泌的McAb特異性良好。 結(jié)論:成功地制備出抗M蛋白的2株McAb和抗NS1蛋白的1株McAb,為進(jìn)一步建立快速特異檢測登革病毒感染的實(shí)驗(yàn)方法提供了有力的工具。
[Abstract]:Objective: in recent years, dengue virus (DV) in many countries and regions in the world, especially in Southeast Asia increased trend, has become a serious public health problem in the world. Due to lack of effective prevention of listed dengue virus infection and vaccine, dengue fever and dengue shock syndrome with high mortality, early diagnosis fast and accurate dengue virus infection is particularly important. At present, the new asked the city of dengue virus infection is the main diagnostic reagent of whole virus or recombinant E protein as antigen specificity and sensitivity needs further study.
This study intends to use the 2 dengue virus type New Guinea strain C (NGC strain) expression of recombinant M protein and NS1 protein in recombinant plasmid cloning and preparation of anti dengue virus type 2 monoclonal antibody of M protein and NS1 protein, and its biological characteristics were identified, and laid the foundation for the next step of preparation for rapid detection the colloidal gold test strip of dengue virus infection.
Methods: expression containing DV2 PRM, Recombinant Prokaryotic expression vector of pET-32a gene of NS1 (+) /prM (+) pET-32a, /M, pQE-30/NS1, and the use of Ni~ (2+) affinity purification of recombinant protein -NTA chromatography resin, were identified by SDS-PAGE, and the Rabbit anti dengue virus immune serum immune activity identification with the recombinant Balb/c protein immune mice were prepared by hybridoma technique of anti dengue virus recombinant protein McAb by indirect ELISA method and Western blot McAb specific Ig subclass identification; the indirect ELISA method of McAb identification, and the titer of the affinity analysis.
Results: recombinant protein pET-32a (+) /M and pQE-30/NS1 were expressed in supernatant and inclusion body. The detection of Rabbit anti dengue virus sera showed that the protein antigen in the supernatant was highly active. Ni~ (2+) -NTA resin affinity chromatography was applied to purify the protein from the supernatant.
By using the hybridoma technique successfully obtained hybridoma cell lines can secrete 3 III 1A6 specific McAb, 3D2 and 4C3. III III 1A6 III, III 4C3 antibody subclasses were IgG1; III 3D2 antibody subclasses supernatant for IgG2a. cell titer were 1:10~6, 1:10~5 and 1:10~6; the specificity of McAb 3 the affinity constants were single strains of anti.Western in 10~7 or bolt proved that the secretion of 3 hybridoma cells.
Conclusion: 2 McAb and 1 NS1 McAb resistant to M protein were successfully prepared, which provided a powerful tool for further establishment of a rapid and specific detection method for dengue virus infection.

【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號(hào)】：R392

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本文編號(hào)：1417878