發(fā)布時(shí)間：2018-01-13 01:29

  本文關(guān)鍵詞：冠狀病毒HCoV-229E S1蛋白片段的原核表達(dá)及鑒定　出處：《佳木斯大學(xué)》2008年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

  更多相關(guān)文章： 冠狀病毒HCoV-229E S1蛋白 原核表達(dá)

【摘要】： 目的:人冠狀病毒(HCoV-229E)屬Ⅰ型冠狀病毒,是引起人類上呼吸道感染的病原,常引起人的普通感冒。其基因組RNA是一不分節(jié)段的正鏈單股RNA,長約27 kb,已知編碼11種蛋白,其中包括4種結(jié)構(gòu)蛋白,分別是刺突蛋白(S)、包膜蛋白(M)、小包膜蛋白(E)和核衣殼蛋白(N)。S蛋白三聚體形成突起,伸出包膜表面,是病毒的主要表面抗原成分,具有受體結(jié)合和膜融合活性,在組織嗜性、細(xì)胞融合和毒力等方面起重要作用。S蛋白由S1和S2兩個(gè)亞基組成,其中S1形成成熟蛋白的球狀部分,包括受體結(jié)合區(qū)(RBD)和高變區(qū)(HVR),而S2相對(duì)保守,包括一段內(nèi)在的融合肽和兩段疏水的七次重復(fù)區(qū)域(HR1和HR2)。這些區(qū)域?qū)τ诓《镜那秩�、�?xì)胞與細(xì)胞間的融合具有重要意義。本研究將靶蛋白鎖定為S1蛋白片段(S1 417—547位氨基酸),克隆獲得冠狀病毒HCoV-229E S1基因片段(S1蛋白1249-1642位核苷酸),在原核表達(dá)系統(tǒng)大腸桿菌中獲得高效表達(dá),對(duì)表達(dá)蛋白加以純化,初步研究其抗原活性。 方法:根據(jù)Genbank提供的HCoV-229E株S基因序列(DQ243973)人工合成冠狀病毒HCoV-229E S1蛋白特異性基因片段,并克隆入pET-21a原核表達(dá)載體,構(gòu)建克隆載體pET-21a-S1,通過PCR鑒定。重組載體轉(zhuǎn)化宿主菌BL21(DE3),經(jīng)IPTG高效誘導(dǎo)表達(dá)得到重組蛋白,用金屬螯合親和層析純化,并通過SDS-PAGE電泳及Western blot對(duì)表達(dá)的重組蛋白進(jìn)行鑒定。 結(jié)果:獲得了主要以包涵體形式存在的目的蛋白,Western blot鑒定其為S1基因片段蛋白。 結(jié)論:成功構(gòu)建了HCoV-229E S1蛋白的表達(dá)載體,并在BL21(DE3)中得到了高效表達(dá),為下一步表達(dá)蛋白免疫原性及疫苗抗病毒保護(hù)性測定打下了基礎(chǔ)。
[Abstract]:Objective: human coronavirus (HCoV-229E) belongs to type I coronavirus and is the cause of human upper respiratory tract infection. Human common cold. Its genome RNA is a non-segmented positive strand single-stranded RNAs, about 27 kb in length, which is known to encode 11 proteins, including 4 structural proteins. The nucleocapsid protein (NV) and the nucleocapsid protein (NV) are the main surface antigen components of the virus, which are formed protuberances and protruded on the surface of the envelope respectively, such as the spiny protein (S), the envelope protein (M), the small envelope protein (E) and the nucleocapsid protein (NV). It has receptor-binding and membrane fusion activity, and plays an important role in tissue eosinophilia, cell fusion and virulence. S protein is composed of S1 and S2 subunits, among which S1 forms the globular part of mature protein. These include receptor binding region (RBD) and hypervariable region (HVRN), while S2 is relatively conserved. These include an intrinsic fusion peptide and two hydrophobic seven repeats, HR1 and HR2. These areas invade the virus. The fusion between cells and cells is of great significance. In this study, the target protein was locked into the S1 protein fragment S417-547 amino acid). The HCoV-229E S1 gene fragment of coronavirus was cloned and expressed in E. coli. The expressed protein was purified and its antigenic activity was preliminarily studied. Methods: according to the S gene sequence of HCoV-229E strain provided by Genbank, DQ243973). Synthesis of HCoV-229E S1 protein specific gene fragment of coronavirus. The recombinant plasmid pET-21a-S1 was cloned into the prokaryotic expression vector of pET-21a and identified by PCR. The recombinant vector was transformed into the host strain BL21DE3). The recombinant protein was induced by IPTG and purified by metal chelating affinity chromatography. The recombinant protein was purified by SDS-PAGE electrophoresis and Western. The expressed recombinant protein was identified by blot. Results: the target protein which mainly existed as inclusion body was identified as S1 gene fragment protein by Western blot. Conclusion: the expression vector of HCoV-229E S1 protein was successfully constructed and highly expressed in BL21DDE3. It lays a foundation for the further immunogenicity of the expressed protein and the antiviral protective test of the vaccine.
【學(xué)位授予單位】：佳木斯大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號(hào)】：R373;R392

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