發(fā)布時(shí)間：2018-01-13 01:18

  本文關(guān)鍵詞：登革4型病毒基因組5’端SLB和cHP二級結(jié)構(gòu)對復(fù)制和翻譯的調(diào)控作用　出處：《中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院》2008年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】： 登革病毒(DEN)為黃病毒屬(Flavivirus)的重要成員,是人類登革熱(DF)、登革出血熱(DHF)和登革休克綜合征(DSS)的病原體。DF和DHF是分布最廣發(fā)病最多、危害較大的蟲媒病毒性疾病。其發(fā)病率及病死率也呈逐年上升的趨勢,但關(guān)于DF至DHF/DSS的發(fā)病機(jī)理迄今尚未闡明,這使登革疫苗和抗病毒藥物研究舉步維艱,因此加強(qiáng)對登革病毒復(fù)制和翻譯調(diào)控分子機(jī)制研究具有重要意義。 登革病毒基因組的5′和3′端存在多個(gè)保守的線性序列及二級結(jié)構(gòu),通過參與基因組環(huán)化及與病毒和宿主蛋白的相互作用來調(diào)控病毒基因組復(fù)制和翻譯。其中5′端二級結(jié)構(gòu)主要包括SLA、SLB和cHP,目前對SLA的研究較為深入,但對SLB和cHP研究報(bào)道較少,鑒于SLB和cHP在所有黃病毒中高度保守,其在病毒復(fù)制、翻譯調(diào)控機(jī)制中可能具有重要作用,本研究以SLB和cHP二級結(jié)構(gòu)為靶點(diǎn),試圖揭示其在病毒復(fù)制和翻譯調(diào)控機(jī)制中的作用。獲得的主要研究結(jié)果包括以下三個(gè)方面。 一、登革4型病毒亞基因組復(fù)制子系統(tǒng)的構(gòu)建及鑒定 為構(gòu)建含有報(bào)告基因的登革4型病毒亞基因組復(fù)制子系統(tǒng),我們首先利用定點(diǎn)誘變PCR方法構(gòu)建prM-E基因缺失的登革4型病毒亞基因組復(fù)制子(DENRP),然后利用CHYSEL(順式水解酶元件cis-acting hydrolase element)技術(shù)分別將海腎螢光素酶(R. luc)和EGFP報(bào)告基因插入到DENRP缺失的結(jié)構(gòu)基因區(qū),構(gòu)建含有R.luc和EGFP報(bào)告基因的復(fù)制子DEN-R.luc2A-RP和DEN-GFP2A-RP。同時(shí)還采用重疊PCR技術(shù)分別構(gòu)建缺失NS5中依賴RNA的RNA聚合酶(RdRp)GDD關(guān)鍵基序的相關(guān)復(fù)制缺陷型復(fù)制子DEN-△GDD-RP、DEN-R.luc2A△GDD-RP和DEN-EGFP2A△GDD-RP,作為相關(guān)的對照。將構(gòu)建的上述復(fù)制子分別線性化并體外轉(zhuǎn)錄成RNA后,將等量的上述RNA經(jīng)電穿孔和脂質(zhì)體法分別轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞,通過間接免疫熒光(IFA)、RT-PCR和R.luc檢測技術(shù)對復(fù)制子進(jìn)行鑒定。結(jié)果表明, DENRP、DEN-R.luc2A-RP和DEN-EGFP2A-RP在BHK-21細(xì)胞中均可穩(wěn)定表達(dá),其中DEN-R.luc2A-RP在轉(zhuǎn)染后3h和72h可形成兩個(gè)穩(wěn)定的信號峰,分別代表病毒早期翻譯和RNA復(fù)制水平,且檢測區(qū)間靈敏度較高,可用于定量檢測復(fù)制子復(fù)制和翻譯水平的改變;DEN-EGFP2A-RP在轉(zhuǎn)染后30h可檢測到GFP陽性信號,但陽性細(xì)胞比例低于5%,其僅適用于進(jìn)行相關(guān)的定性研究;DENRP可分別穩(wěn)定表達(dá)R.luc和EGFP報(bào)告基因,表明其載體性狀較穩(wěn)定,可探討進(jìn)一步將其改造為表達(dá)載體。此外,對電穿孔和脂質(zhì)體法兩種轉(zhuǎn)染方法的比較結(jié)果表明,脂質(zhì)體方法操作簡便、更易于獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染,轉(zhuǎn)染方法應(yīng)首選脂質(zhì)體法。本研究所購建的含有報(bào)告基因的登革4型病毒亞基因組復(fù)制子系統(tǒng)在BHK-21細(xì)胞中均獲得了穩(wěn)定表達(dá),上述復(fù)制子的成功構(gòu)建為研究SLB和cHP在病毒復(fù)制和翻譯調(diào)控機(jī)制中作用奠定了基礎(chǔ)。 二、登革4型病毒5′非編碼區(qū)SLB莖環(huán)結(jié)構(gòu)對病毒復(fù)制和翻譯的調(diào)控作用 為探討5′非編碼區(qū)SLB二級結(jié)構(gòu)對病毒復(fù)制和翻譯的影響。我們首先利用mfold軟件對截取的登革4型病毒基因組5′端156nt二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測,確定以SLB二級結(jié)構(gòu)為靶點(diǎn),以上述構(gòu)建的含有海腎螢光素酶報(bào)告基因的登革4型病毒亞基因組復(fù)制子體外復(fù)制模型為技術(shù)平臺(tái),通過重疊PCR構(gòu)建SLB系列突變體: SLB1,缺失第82-87位核苷酸,使5′UAR部分環(huán)化序列缺失,并破壞其保守莖環(huán)結(jié)構(gòu);SLB2,在次環(huán)第77位核苷酸引入突變(G/C)破壞其環(huán)狀結(jié)構(gòu); SLB3,在第77-78位核苷酸引入突變(AG/GA),該突變未破壞該次環(huán)結(jié)構(gòu)。將陽性和陰性對照DEN-R.luc2A -RP和DEN-R.luc2A△GDD-RP及上述3個(gè)突變體分別線性化并體外轉(zhuǎn)錄成RNA后,取等量各轉(zhuǎn)錄體RNA,以脂質(zhì)體法分別轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞,通過間接免疫熒光(IFA)、RT-PCR、R.luc報(bào)告基因和實(shí)時(shí)RT-PCR技術(shù)對突變體復(fù)制和翻譯進(jìn)行檢測。結(jié)果表明, SLB1的復(fù)制和翻譯效率均下降,該突變體可作為制備減毒活疫苗的候選靶標(biāo)。SLB2的復(fù)制受到嚴(yán)重抑制,但對病毒翻譯無顯著影響;SLB3的復(fù)制和翻譯均受到了嚴(yán)重抑制。這些結(jié)果表明SLB次環(huán)的核苷酸及其二級結(jié)構(gòu)高度保守,在病毒復(fù)制中起重要作用。這為最終闡明SLB保守二級結(jié)構(gòu)在病毒復(fù)制翻譯調(diào)控機(jī)制中的作用奠定了基礎(chǔ)。 三、登革4型病毒基因組5′端cHP發(fā)卡結(jié)構(gòu)對病毒復(fù)制和翻譯的調(diào)控作用 為研究登革4型病毒C基因N末端保守的cHP發(fā)卡結(jié)構(gòu)對病毒復(fù)制和翻譯的影響,我們以cHP發(fā)卡結(jié)構(gòu)為靶點(diǎn),在DEN-R.luc2A-RP基礎(chǔ)上,通過重疊PCR方法構(gòu)建cHP系列突變體(H1-H6):H1完全缺失cHP二級結(jié)構(gòu),H2和H3均在頂環(huán)部位引入突變,目的是研究頂環(huán)核苷酸序列的改變對病毒復(fù)制和翻譯的影響,H4、H5和H6通過對其莖部二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行缺失、突變及回復(fù)突變,探討該莖部結(jié)構(gòu)的改變對病毒復(fù)制和翻譯的影響。將陽性和陰性對照DEN-R.luc2A -RP和DEN-R.luc2A△GDD-RP及上述6個(gè)突變體分別線性化并體外轉(zhuǎn)錄成RNA后,取等量各轉(zhuǎn)錄體RNA,以脂質(zhì)體法分別轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞,通過間接免疫熒光(IFA)、RT-PCR、R.luc報(bào)告基因和實(shí)時(shí)RT-PCR技術(shù)對突變體復(fù)制和翻譯水平進(jìn)行檢測。RT-PCR和間接免疫熒光檢測結(jié)果表明,上述各突變體均可在BHK-21細(xì)胞中復(fù)制并表達(dá)登革4型病毒特異蛋白,證明其均非致死性突變。在此基礎(chǔ)上,進(jìn)一步通過R.luc報(bào)告基因和實(shí)時(shí)定量RT-PCR方法分別定量檢測各突變體轉(zhuǎn)染后不同時(shí)間點(diǎn)螢光素活性和突變體mRNA拷貝數(shù),實(shí)時(shí)監(jiān)測各突變體復(fù)制和翻譯水平的改變。結(jié)果表明,無論是在該發(fā)卡結(jié)構(gòu)的頂環(huán)中引入突變,還是在莖部缺失突變破壞或恢復(fù)該結(jié)構(gòu),對病毒早期翻譯并無顯著影響,但病毒RNA復(fù)制均受到嚴(yán)重抑制。表明cHP發(fā)卡結(jié)構(gòu)參與病毒復(fù)制的調(diào)控。此外,本研究所構(gòu)建的6個(gè)cHP突變體均存在不同程度的復(fù)制缺陷,但其翻譯水平并未顯著下降,其在所有的檢測點(diǎn)均可持續(xù)穩(wěn)定復(fù)制。上述結(jié)果的獲得為最終闡明登革4型病毒cHP保守二級結(jié)構(gòu)在病毒復(fù)制翻譯調(diào)控機(jī)制中的作用和登革新型減毒疫苗的研制奠定了基礎(chǔ)。 本研究成功構(gòu)建了登革4型病毒亞基因組復(fù)制子系統(tǒng),其中含有海腎螢光素酶報(bào)告基因的復(fù)制子在3h和72h獲得的檢測信號可區(qū)分病毒早期翻譯及后期RNA復(fù)制。在此基礎(chǔ)上,我們對SLB和cHP在病毒復(fù)制和翻譯調(diào)控機(jī)制中的作用進(jìn)行了系統(tǒng)研究。結(jié)果表明,SLB和cHP二級結(jié)構(gòu)在黃病毒中高度保守,均參與了病毒復(fù)制和翻譯調(diào)控,其中,H1-H6和SLB1突變使基因組復(fù)制水平顯著下調(diào),SLB2和SLB3突變基因組復(fù)制受到了完全抑制,但SLB2早期的翻譯并未受到抑制。此外H1- H6及SLB1突變體均存在不同程度的復(fù)制水平下降,但仍可穩(wěn)定復(fù)制并翻譯病毒蛋白,有可能成為新的登革病毒減毒活疫苗候選株。上述研究結(jié)果為最終闡明SLB和cHP保守二級結(jié)構(gòu)在病毒復(fù)制翻譯調(diào)控機(jī)制中的作用奠定了基礎(chǔ)。
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【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號】：R373

【參考文獻(xiàn)】

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1 盧杰;張珈敏;林美娟;曹旭;胡遠(yuǎn)揚(yáng);;RNA病毒翻譯調(diào)控元件——內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)[J];中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào);2007年07期

2 朱武洋;姜濤;秦成峰;陳水平;于曼;鄧永強(qiáng);于學(xué)東;秦鄂德;;衣殼蛋白缺失突變對登革病毒致病性及免疫原性的影響[J];自然科學(xué)進(jìn)展;2007年02期

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本文編號：1416825