本文關(guān)鍵詞：小鼠B淋巴細(xì)胞活化刺激因子可溶性片段的酵母表達(dá)、純化及生物學(xué)活性的初步鑒定　出處：《暨南大學(xué)》2013年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

  更多相關(guān)文章： B淋巴細(xì)胞活化刺激因子 小鼠 畢赤酵母 基因表達(dá) 純化 生物活性

【摘要】：目的克隆小鼠B淋巴細(xì)胞活化刺激因子（B cell activating factor belonging tothe TNF family，BAFF）可溶性片段，表達(dá)并純化出有生物學(xué)活性的小鼠可溶性（mouse soluble）msBAFF蛋白，為探討小鼠BAFF可溶性蛋白作為B細(xì)胞雜交瘤生長促進(jìn)劑和佐劑的潛在用途提供原料支持。 方法分離BALB/c小鼠外周血單核細(xì)胞，提取總RNA；反轉(zhuǎn)錄后，以cDNA產(chǎn)物為模板擴(kuò)增目的基因，將目的基因構(gòu)建到克隆載體pMD18-T中，經(jīng)轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞后挑取陽性細(xì)菌抽提質(zhì)粒進(jìn)行酶切和測序鑒定。將測序鑒定為正確的質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，回收目的片段，克隆至pPICZαA表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽性轉(zhuǎn)化子提取質(zhì)粒并酶切和測序鑒定；將鑒定正確的質(zhì)粒導(dǎo)入巴斯德畢赤酵母GS115，使用Zeocin加壓篩選高抗性的菌株；篩選到的陽性酵母工程菌進(jìn)行甲醇誘導(dǎo)表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物以SDS-PAGE鑒定。依次使用硫酸銨沉淀及Q Sepharose XL陰離子交換柱純化目的蛋白msBAFF。將純化后的msBAFF與anti-IgM共刺激B淋巴細(xì)胞，使用CCK8試劑盒檢測B淋巴細(xì)胞的增殖情況。將msBAFF與抗原共同免疫小鼠，檢測小鼠免疫后的血清抗體效價(jià)，分析msBAFF對小鼠免疫后抗體產(chǎn)生的影響。 結(jié)果瓊脂糖凝膠電泳和基因測序結(jié)果顯示PCR所得基因序列與預(yù)期相符，可知已克隆得到小鼠BAFF基因可溶性片段。酶切和測序鑒定結(jié)果顯示目的DNA已正確插入到克隆和表達(dá)載體，SDS-PAGE結(jié)果顯示酵母表達(dá)的目的蛋白分子量約20kDa，與預(yù)期相符，表明小鼠BAFF蛋白可溶性片段獲得表達(dá)；陰離子純化柱洗脫產(chǎn)物SDS-PAGE檢測結(jié)果顯示，0.3M NaCl可較好的將目的蛋白msBAFF從柱上洗脫下來。體外B細(xì)胞刺激實(shí)驗(yàn)中，CCK8法結(jié)果顯示msBAFF與anti-IgM共刺激組的OD值明顯高于對照組，表明該msBAFF蛋白具有促B細(xì)胞增殖的生物學(xué)活性。msBAFF與抗原共免疫小鼠一次、兩次和三次后，ELISA檢測其血清抗體效價(jià)，結(jié)果顯示血清效價(jià)隨著免疫次數(shù)的增加而增加，但是較高濃度的msBAFF對小鼠抗體產(chǎn)生具有抑制作用。 結(jié)論本實(shí)驗(yàn)克隆得到了小鼠BAFF可溶性片段基因，經(jīng)酵母表達(dá)并純化后得到了較純的小鼠BAFF可溶性多肽片段。體外B細(xì)胞刺激實(shí)驗(yàn)中，該蛋白可顯著促進(jìn)B細(xì)胞的增殖，說明該小鼠BAFF可溶性片段具有良好的促B細(xì)胞增殖活性。初步體內(nèi)試驗(yàn)表明，較高濃度的msBAFF對小鼠抗體產(chǎn)生有抑制作用，其具體機(jī)理有待探討。
[Abstract]:Objective to clone mouse B lymphocyte activation factor (B cell activating factor stimulated belonging tothe TNF family, BAFF) soluble fragment, expression and purification of mouse soluble bioactive msBAFF protein (mouse soluble), to investigate the soluble BAFF protein in mice as B cell hybridoma growth promoter and potential use of adjuvant and providing material support.
Methods blood mononuclear cells isolated from BALB/c mice peripheral, extraction of total RNA; after reverse transcription, cDNA products as template. The target gene to construct the gene cloned into vector pMD18-T and transformed to competent cells after DH5 alpha positive bacterial plasmids were identified by restriction enzyme digestion and sequencing. The sequencing is correct plasmids were digested, the target fragment was reclaimed and cloned into pPICZ expression vector and transformed into DH5 alpha A alpha competent cells, then the positive transformant Plasmid Extraction and enzyme digestion and sequencing; the identification of the correct plasmid into Pasteur Pichia pastoris GS115, using the Zeocin pressure screening high resistant strains; methanol induced expression of yeast the engineering bacteria screened and identified by SDS-PAGE. The expressed product by using ammonium sulfate precipitation and Q Sepharose XL anion exchange column to purify the protein msBAFF. msBAFF and anti-IgM will be purified The B lymphocytes were co stimulated. The proliferation of B lymphocytes was detected by CCK8 kit. MsBAFF and antigen were co immunized to mice, and the serum titer of mice after immunization was detected, and the effect of msBAFF on the antibody production after immunization in mice was analyzed.
The results of agarose gel electrophoresis and gene sequencing showed the PCR gene sequence consistent with expectations, we have cloned the mouse BAFF gene fragment. The soluble enzyme digestion and sequencing results showed that DNA has been correctly inserted into cloning and expression vector of target protein SDS-PAGE showed that yeast expression amount of about 20kDa, consistent with expectations that mouse BAFF protein expression and purification of soluble fragments obtained; anion column elution products SDS-PAGE assay showed that 0.3M NaCl could be the target protein msBAFF eluted from the column. B cells stimulated in vitro experiments, CCK8 results showed that the OD value of msBAFF and anti-IgM co stimulation group was significantly higher than the control group, indicating that the msBAFF protein possesses biological the activity of.MsBAFF antigen and B cell proliferative co immunized mice once, two times and three times, ELISA detected the serum antibody titer, the results show The serum titer increased with the increase of the number of immunization, but the high concentration of msBAFF inhibited the antibody production in mice.
Conclusion the cloned mouse BAFF gene by yeast soluble fragment, obtained after expression and purification of mouse BAFF soluble peptide fragments. Compared with pure B cells in vitro experiment, the protein can significantly promote the proliferation of B cells, indicating that the mouse soluble BAFF fragment with B cell proliferative activity. Results in test of high concentration of msBAFF has inhibitory effect on mouse antibody production, to evaluate the specific mechanism.

【學(xué)位授予單位】：暨南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R392

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本文編號：1409919