本文關鍵詞：體外誘導人脂肪干細胞向內(nèi)皮細胞分化的實驗研究　出處：《山西醫(yī)科大學》2009年碩士論文　論文類型：學位論文

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【摘要】： 第一部分人脂肪來源的間充質干細胞的生物學特性觀察 目的觀察人脂肪間充質干細胞(human adipose-derived stem cells , hADSCs)的形態(tài)學,生長動力學及細胞表面標志抗原。 方法采用酶消化法分離培養(yǎng)脂肪間充質干細胞,倒置相差顯微鏡下觀察其生長和形態(tài)學變化;MTT比色法觀察細胞增殖活性;流式細胞技術分別檢測細胞周期和原代、第2代、第4代脂肪間充質干細胞表面抗原CD31、CD34、CD44、CD29的表達。 結果1.在脂肪組織中存在能不斷增殖的未成熟細胞,經(jīng)多次傳代后仍保留很強的增殖能力,倒置相差顯微鏡下觀察呈成纖維細胞樣。 2.MTT比色法證實其有很強的增殖活性,隨傳代降低不明顯。 3.流式細胞周期檢測顯示G1期細胞占絕大多數(shù),達到86.19%,S期為6.09%,表明大多數(shù)細胞處于靜止期,是一群處于未分化狀態(tài)的非定向細胞。 4.其形態(tài)學及表面標記物與骨髓間充質干細胞類似,間充質干細胞相關的表面抗原CD29、CD44隨著傳代表達水平逐漸增高,與原代細胞比較沒有顯著差異(p0.05),內(nèi)皮細胞標志CD31陰性表達。造血干細胞標志CD34隨細胞培養(yǎng)時間延長表達水平明顯降低,與原代細胞比較有顯著差異(p0.05)。 第二部分體外誘導人脂肪干細胞向內(nèi)皮細胞的分化 目的體外誘導人脂肪間充質干細胞向內(nèi)皮細胞的分化,探索其誘導條件,為組織工程學種子細胞的來源及其臨床應用提供實驗基礎。 方法酶消化法分離培養(yǎng)脂肪干細胞,當傳至第3代時用內(nèi)皮細胞生長因子(VEGF)和堿性成纖維細胞生長因子(b-FGF)誘導其向內(nèi)皮細胞分化。實驗分為VEGF 50ng/ml加b-FGF 10ng/ml和VEGF 20ng/ml加b-FGF 10ng/ml兩組,用流式細胞儀檢測其表面標記物CD34、CD31的表達;在熒光顯微鏡下觀察其吞噬乙�；兔芏戎鞍�(DiI-ac-LDL)和結合植物凝集素(FITC-Lectin)的能力;用細胞免疫熒光法檢測Ⅷ因子的表達;用RT-PCR技術測定細胞中CD133mRNA和CD144mRNA的表達。 結果1.流式細胞儀檢測結果顯示CD31、CD34表達水平隨誘導時間的延長而逐漸增加,同一誘導時間的不同濃度組之間比較沒有顯著差異(p0.05),同一誘導濃度不同誘導時間組之間比較有顯著差異(p0.05)。 2.熒光顯微鏡下觀察到細胞吞噬DiI-ac-LDL顯紅色熒光,陽性率達94%以上;與Lectin結合顯綠色熒光,陽性率達95%;雙染色為橙色熒光,陽性率達90%以上。 3.熒光顯微鏡下可見大部分細胞胞漿內(nèi)呈現(xiàn)綠色熒光,即胞漿內(nèi)表達Ⅷ因子。 4.CD144mRNA表達水平隨誘導時間的延長而逐漸增加,與空白對照組比較有顯著差異(p0.05),CD133mRNA在誘導第4天有一定表達,第8天時表達降低,與空白對照組比較均有顯著差異(p0.05)。 結論 1.通過酶消化法可從人脂肪組織中獲取間充質干細胞,其與骨髓間充質干細胞相似,具有很強的增殖分化能力,通過流式細胞技術檢測到其表達間充質干細胞相關表面標志。 2. VEGF、b-FGF可誘導脂肪干細胞成內(nèi)皮樣細胞,且對VEGF濃度有很大的依賴性,隨著誘導時間的延長其表面標志物由內(nèi)皮祖細胞向成熟內(nèi)皮細胞轉變。其較內(nèi)皮祖細胞容易獲得,成為組織工程學種子細胞的選擇之一。
[Abstract]:The biological characteristics of mesenchymal stem cells from the first part of human fat
Objective To observe the morphology, growth kinetics and surface marker antigen of human adipose-derived stem cells (hADSCs).
Methods by using enzyme digestion method cultured adipose derived mesenchymal stem cells, inverted to observe the growth and morphological changes under the microscope to observe cell proliferation; MTT colorimetric assay; flow cytometry was used to detect the cell cycle and the original generation, second generation, fourth generation of adipose derived mesenchymal stem cell surface antigen CD31, CD34. CD44, the expression of CD29.
Results 1., there were immature cells that could proliferate in adipose tissue. After repeated passage, they still had strong proliferative ability.
2.MTT colorimetric assay showed that it had strong proliferative activity and was not obvious with the decrease of passage.
3. flow cytometry showed that the majority of G1 cells were 86.19% and S 6.09%, indicating that most cells were at a quiescent stage, and they were a group of undirected cells.
4. the morphology and surface markers of bone marrow mesenchymal stem cells, mesenchymal stem cell associated surface antigens CD29, CD44 increased gradually with the passage of the level, and the primary cells showed no significant difference (P0.05), endothelial cell marker CD31 negative expression cells CD34 with cell culture. The extension of time. Significantly lower levels of stem, there was significant difference compared with the primary cells (P0.05).
Differentiation of human adipose stem cells into endothelial cells in vitro in the second part
Objective to induce the differentiation of human adipose derived mesenchymal stem cells into endothelial cells in vitro, and explore the induction conditions, so as to provide experimental basis for the source and clinical application of tissue engineering seed cells.
Isolation and culture of adipose derived stem cells by enzyme digestion method, when passed third generations with endothelial cell growth factor (VEGF) and basic fibroblast growth factor (b-FGF) induced to differentiate into endothelial cells. The experiment was divided into VEGF 50ng/ml and b-FGF 10ng/ml and VEGF 20ng/ml and b-FGF 10ng/ml in the two groups, with the detection of surface markers CD34 flow cytometry, the expression of CD31; observe the phagocytosis of acetylated low density lipoprotein under fluorescent microscope (DiI-ac-LDL) and binding lectin (FITC-Lectin) expression ability; immunofluorescence assay of factor VIII; Determination of the expression of CD133mRNA and CD144mRNA cells by using RT-PCR technology.
The test results of 1. flow cytometry showed that CD31 expression level of CD34, with the prolonged induction time gradually increased, there was no significant difference between different concentration groups at the same time (P0.05), induced by the same concentration induced by different induction time had significant difference between groups (P0.05).
2. under fluorescence microscope, phagocytosis of DiI-ac-LDL showed red fluorescence. The positive rate was over 94%. The positive rate of green fluorescence with Lectin was 95%, and the double staining was orange fluorescence, the positive rate was over 90%.
3. under the fluorescence microscope in the cytoplasm of most cells showed green fluorescence expression of factor VIII in the cytoplasm.
The expression level of 4.CD144mRNA increased with the prolongation of induction time. There was a significant difference between the expression level of P0.05 and the blank control group (CD133mRNA). There was a certain expression of CD133mRNA on the fourth day of induction, and the expression decreased on the eighth day, which was significantly different from that in the blank control group (P0.05).
conclusion
1., through enzyme digestion, mesenchymal stem cells can be obtained from human adipose tissue. It is similar to bone marrow mesenchymal stem cells, and has strong proliferation and differentiation ability. The related surface markers of mesenchymal stem cells can be detected by flow cytometry.
2. VEGF, b-FGF can induce adipose derived stem cells into endothelial like cells, and have a great dependence on the concentration of VEGF, with the extension of time the transformation induced by surface markers by endothelial progenitor cells into mature endothelial cells. The endothelial progenitor cells are easy to obtain, become one of the seed cells for tissue engineering.

【學位授予單位】：山西醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2009
【分類號】：R329

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