本文關(guān)鍵詞：熱休克蛋白70重組腺病毒載體的構(gòu)建及鑒定　出處：《青島大學(xué)》2008年碩士論文　論文類(lèi)型：學(xué)位論文

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【摘要】： 目的構(gòu)建人熱休克蛋70(heat shock protein70,HSP70)的腺病毒表達(dá)載體,旨在將成功構(gòu)建的攜帶外源基因HSP70的重組腺病毒感染靶細(xì)胞,從而為進(jìn)一步探討HSP70對(duì)應(yīng)激狀態(tài)下細(xì)胞的保護(hù)作用奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 方法自熱休克處理后的人宮頸癌細(xì)胞系Hela中提取細(xì)胞總RNA,經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)后,利用人工合成的引物行PCR擴(kuò)增,獲得目的基因HSP70的cDNA。將外源cDNA定向亞克隆到pAdTrack-CMV質(zhì)粒上,采用AdEasy系統(tǒng)在原核細(xì)胞E.coli BJ5183中完成穿梭質(zhì)粒pAdTrack-CMV-HSP70與骨架質(zhì)粒pAdEasy-1之間的高效同源重組,構(gòu)建HSP70重組腺病毒載體。重組體經(jīng)篩選后,脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染人胚腎293細(xì)胞,包裝產(chǎn)生重組腺病毒vAd-HSP70。最后,收獲病毒進(jìn)行滴度鑒定,用RT-PCR方法檢測(cè)目的基因在人宮頸癌Hela細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。 結(jié)果通過(guò)PCR、序列測(cè)定以及限制性酶切證實(shí)HSP70基因能夠正確插入腺病毒表達(dá)載體,并在HEK293細(xì)胞中包裝出重組腺病毒;熒光顯微鏡下可觀察到GFP的表達(dá),收獲病毒的滴度為3.2×10~(12)IU/L,獲得了病毒滴度較高的重組腺病毒。 結(jié)論本研究成功的構(gòu)建了pAd-HSP70重組腺病毒表達(dá)載體,并在人胚腎293細(xì)胞中包裝獲得重組腺病毒vAd-HSP70,且證明了重組腺病毒vAd-HSP70可在人宮頸癌系Hela細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)目的基因并有效轉(zhuǎn)錄。
[Abstract]:Objective to construct the adenovirus expression vector of heat shock protein 70 (HSP70). The aim of this study was to infect the target cells with recombinant adenovirus carrying exogenous gene HSP70, thus laying an experimental foundation for the further study of the protective effect of HSP70 on the cells under stress. Methods Total RNAs were extracted from human cervical cancer cell line Hela after self-heat shock. After reverse transcription, PCR amplification was performed with synthetic primers. The cDNA of the target gene HSP70 was obtained. The exogenous cDNA was subcloned into the pAdTrack-CMV plasmid. Application of AdEasy system in E.coli of prokaryotic cells. The efficient homologous recombination of shuttle plasmid pAdTrack-CMV-HSP70 and skeleton plasmid pAdEasy-1 was completed in BJ5183. The recombinant adenovirus vector of HSP70 was constructed. After screening, the recombinant adenovirus vAd-HSP70was transfected into human embryonic kidney 293 cells by liposome method. Finally, the recombinant adenovirus vAd-HSP70was produced. The expression of target gene in human cervical cancer Hela cells was detected by RT-PCR assay. Results HSP70 gene was correctly inserted into adenovirus expression vector by PCR sequencing and restriction endonuclease digestion and the recombinant adenovirus was packaged in HEK293 cells. The expression of GFP was observed under fluorescence microscope. The titer of the virus was 3.2 脳 10 ~ (-1) ~ (12) IUU / L, and the recombinant adenovirus with high titer was obtained. Conclusion the recombinant adenovirus expression vector of pAd-HSP70 was successfully constructed and the recombinant adenovirus vAd-HSP70 was obtained by packaging the recombinant adenovirus in 293 cells of human embryonic kidney. It was proved that recombinant adenovirus vAd-HSP70 could stably express the target gene and transcribe effectively in human cervical cancer Hela cells.
【學(xué)位授予單位】：青島大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類(lèi)號(hào)】：R346

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本文編號(hào)：1405027