發(fā)布時間：2018-01-09 15:11

  本文關(guān)鍵詞：循環(huán)平滑肌祖細(xì)胞在低氧性肺無肌細(xì)動脈肌化中的作用　出處：《華中科技大學(xué)》2009年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】： 長期慢性低氧是引起肺動脈重塑(Pulmonary artery remodeling，PAR)進(jìn)而導(dǎo)致肺動脈高壓(Pulmonary hypertension，PH)的重要因素。肺無肌細(xì)動脈肌化是低氧引起的PAR的重要特征之一。既往認(rèn)為，引起肺無肌細(xì)動脈肌化的機(jī)制主要是由于臨近動脈的血管平滑肌細(xì)胞(Vascular smooth muscle cells，VSMC)遷移及增殖而來，但臨床針對VSMC的遷移和增殖治療效果不明顯，提示尚存在其他的機(jī)制。Myocardin是血清反應(yīng)因子(Serum response factor，SRF)的一種共輔助因子，參與平滑肌細(xì)胞(Smooth muscle cells，SMCs)及心肌細(xì)胞的分化，是SMCs和心肌細(xì)胞分化所必須的。用myocardin過表達(dá)載體轉(zhuǎn)染纖維母細(xì)胞和干細(xì)胞均可使其表達(dá)SMCs的分子標(biāo)志，且移植到心急梗死灶中的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone marrow-derived mesenchymal stemceils，MSCs)強(qiáng)制表達(dá)myocardin后心功能得到明顯改善，結(jié)果證實(shí)移植的MSCs在myocardin的調(diào)控下有效分化為心肌細(xì)胞。已經(jīng)證實(shí)循環(huán)血液存在平滑肌祖細(xì)胞(Smooth muscle progenitor cells，SPCs)。在低氧條件下SPCs可以歸巢到動脈粥樣硬化斑塊及缺血的肢體等病灶中并發(fā)揮生物學(xué)作用。慢性低氧不僅動員骨髓干細(xì)胞而且可誘導(dǎo)循環(huán)c-kit~+祖細(xì)胞參與肺動脈外膜重塑及肺動脈滋養(yǎng)血管的形成。鑒于以上研究基礎(chǔ)，我們設(shè)想：在慢性低氧條件下，循環(huán)SPCs歸巢至肺無肌細(xì)動脈，在myocardin的調(diào)控下分化為VSMCs從而參與了低氧性肺無肌細(xì)動脈的肌化。本研究分三個部分。 第一部分：大鼠循環(huán)平滑肌祖細(xì)胞的分離、鑒定及分化 目的：分離大鼠循環(huán)血液中的平滑肌祖細(xì)胞(SPCs)并鑒定其表型，為后續(xù)研究打下基礎(chǔ)。方法：采用單核細(xì)胞集落刺激因子(M-CSF)注射法動員大鼠骨髓干細(xì)胞，第六天收集循環(huán)血液經(jīng)密度梯度離心法獲得單個核細(xì)胞(MNCs)，用磁激活的細(xì)胞分選法(MACS)分離具有CXCR4~+／PDGFRβ~+表型的祖細(xì)胞。采用富含PDGF-BB的培養(yǎng)液常規(guī)條件下誘導(dǎo)祖細(xì)胞分化，用細(xì)胞免疫熒光，RT-PCR，Western blot檢測分化細(xì)胞的SMCs表型標(biāo)記物，透射電鏡檢測分化細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)從而判斷分離的祖細(xì)胞的SMCs分化潛能；低氧(1％O_2)條件下培養(yǎng)上述祖細(xì)胞，觀察祖細(xì)胞的SMCs分化情況，用細(xì)胞免疫熒光，RT-PCR，Western blot檢測分化細(xì)胞的SMCs表型標(biāo)記物，透射電鏡檢測分化細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)從而判斷低氧誘導(dǎo)的分化細(xì)胞是否為典型的SMCs。結(jié)果：從G-CSF動員的大鼠外周血液MNCs中成功分離出具有CXCR4~+／PDGFRβ~+表型的祖細(xì)胞，F(xiàn)CM證實(shí)純度達(dá)93．7％，細(xì)胞免疫熒光證實(shí)祖細(xì)胞表達(dá)CXCR4及PDGFRβ。經(jīng)富含PDGF-BB的無血清培養(yǎng)液誘導(dǎo)后，CXCR4~+／PDGFRβ~+祖細(xì)胞發(fā)生了典型的形態(tài)學(xué)變化，從小、圓形細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)槎嘟切�、梭型�?xì)胞，細(xì)胞長滿后具有SMCs的“峰谷”特征；免疫熒光、RT-PCR及western blot檢測到分化細(xì)胞表達(dá)α-SMA，SM22α，calponin及SM-MHC，透射電鏡證實(shí)分化細(xì)胞具有肌絲、密體，密斑等SMCs超微結(jié)構(gòu)；低氧條件下，CXCR4~+／PDGFRβ~+祖細(xì)胞具有和PDGF-BB誘導(dǎo)下相似的形態(tài)學(xué)變化；免疫熒光、RT-PCR及Western blot檢測到分化細(xì)胞表達(dá)α-SMA，SM22α，calponin及SM-MHC，透射電鏡亦證實(shí)分化細(xì)胞具有肌絲、密體，密斑等SMCs超微結(jié)構(gòu)。結(jié)論：大鼠循環(huán)CXCR4+~／PDGFRβ~+祖細(xì)胞為平滑肌祖細(xì)胞，體外低氧可誘導(dǎo)其分化為成熟的SMCs。 第二部分：Myocardin在CXCR4~+／PDGFRβ~+祖細(xì)胞體外SMC分化中的表達(dá)及作用 目的：檢測Myocardin在CXCR4~+／PDGFRβ~+祖細(xì)胞分化過程中的表達(dá)，探討干擾myocardin后對CXCR4~+／PDGFRβ~+祖細(xì)胞分化為SMCs的影響。方法：以慢病毒質(zhì)粒pGCSIL-GFP為基礎(chǔ)構(gòu)建針對myocardin mRNA靶點(diǎn)的慢病毒干擾質(zhì)粒(lentivirus-GFP-shMyocd)及陰性對照質(zhì)粒(lentivirus-GFP-NC)；用有效靶點(diǎn)的myocardin慢病毒干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CXCR4+~／PDGFRβ~+祖細(xì)胞獲得穩(wěn)定表達(dá)，將穩(wěn)定轉(zhuǎn)染干擾病毒的祖細(xì)胞置于低氧條件下誘導(dǎo)分化，用RT-PCR及western blot檢測不同時間點(diǎn)分化細(xì)胞內(nèi)的myocardin及SMCs分化標(biāo)志基因的表達(dá)。結(jié)果：成功構(gòu)建滴度為1×10~9TU／ml的lentivirus-GFP-shMyocd和5×10~9TU／ml的lentivirus-GFP-NC干擾病毒。RT-PCR及western blot證實(shí)剛分離的CXCR4~+／PDGFRβ~+祖細(xì)胞不表達(dá)myocardin，PDGF-BB和低氧誘導(dǎo)后7天后表達(dá)myocardin，14天達(dá)到峰值，21天分化細(xì)胞成熟時其表達(dá)下降。用lentivirus-GFP-shMyocd預(yù)轉(zhuǎn)染CXCR4~+／PDGFRβ~+祖細(xì)胞后再將細(xì)胞置于低氧條件下分化，RT-PCR及western blot結(jié)果顯示lentivirus-GFP-shMyocd質(zhì)粒有效減低了低氧所誘導(dǎo)的myocardin表達(dá)，敲減后的祖細(xì)胞中SMCs分化標(biāo)記基因表達(dá)趨勢與myocardin表達(dá)下降趨勢相一致。結(jié)論：體外低氧誘導(dǎo)CXCR4~+／PDGFRβ~+祖細(xì)胞中myocardin的表達(dá)介導(dǎo)了祖細(xì)胞向SMCs分化。 第三部分：Myocardin調(diào)控CXCR4~+/PDGFRβ~+ SPCs參與低氧性肺無肌細(xì)動脈肌化 目的：探討慢性低氧是否誘導(dǎo)循環(huán)平滑肌祖細(xì)胞(SPCs)歸巢至肺無肌細(xì)動脈以及該歸巢的SPCs在低氧誘導(dǎo)的肺無肌細(xì)動脈肌化中的作用。方法：GFP轉(zhuǎn)基因C57BL6／J小鼠骨髓細(xì)胞移植到經(jīng)過亞致死量~(60)Co照射的Wt C57BL6／J小鼠以形成骨髓細(xì)胞嵌合小鼠，嵌合成功的小鼠低氧(10％O_2)飼養(yǎng)4wk，采用激光共聚焦顯微鏡觀察肺動脈上GFP熒光的分布，western blot分析肺組織內(nèi)GFP蛋白的表達(dá)；用慢病毒干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CXCR4~+／PDGFRβ~+ SPC形成穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞，將該穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的SPCs經(jīng)頸靜脈輸入Wistar大鼠。經(jīng)6wk低氧后檢測大鼠平均肺動脈壓(mPAP)，處死大鼠取出肺組織，免組織化學(xué)染色檢測肺血管α-SMA表達(dá)，結(jié)合彈力纖維染色判斷肺動脈肌化程度，測定大鼠肌化血管壁的平均厚度；顯微切割肌化血管并經(jīng)定量PCR檢測肌化肺動脈中myocardin mRNA的表達(dá)；同時冰凍切片經(jīng)免疫熒光標(biāo)記VEVSMC的α-SMA，激光共聚焦顯微鏡下觀察α-SMA的表達(dá)及定位，，結(jié)合GFP的表達(dá)情況判斷輸入的SPCs在肌化動脈上的定位及分化情況。結(jié)果：骨髓細(xì)胞嵌合小鼠經(jīng)4wk低氧后觀察到肺血管中具有較多的GFP信號，western blot亦證實(shí)嵌合小鼠低氧下較常氧條件下肺組織內(nèi)GFP蛋白顯著增加。Wistar大鼠經(jīng)6wk低氧后，mPAP、肺動脈肌化程度及肌化血管平均厚度明較常氧組升高。接受SPCs輸注低氧大鼠較未接受SPCs輸注大鼠其mPAP、肺動脈肌化程度、肌化血管平均厚度均高于單純低氧組。顯微鏡下見SPCs輸注低氧大鼠肌化動脈壁見GFP陽性細(xì)胞，部分細(xì)胞同時α-SMA陽性。接受lentivirus-GFP-shMyocd轉(zhuǎn)染SPCs低氧大鼠其mPAP、肺動脈肌化程度、肌化動脈平均厚度較lentivirus-GFP-NC轉(zhuǎn)染SPCs低氧大鼠明顯減低。最后，對顯微切割分離的肌化肺動脈組織myocardin mRNA定量分析表明，輸注轉(zhuǎn)染lentivirus-GFP-shMyocd的SPCs低氧大鼠肌化肺動脈myocardinmRNA較轉(zhuǎn)染對照質(zhì)粒祖細(xì)胞低氧大鼠及單純輸注祖細(xì)胞低氧大鼠均顯著下降，并與其mPAP及肌化程度變化相一致。結(jié)論：低氧誘導(dǎo)歸巢到肺動脈的CXCR4~+/PDGFRβ~+SPCs表達(dá)myocardin并調(diào)控其分化為VSMCs從而參與低氧性肺無肌細(xì)動脈肌化。 結(jié)論： 結(jié)合前面三部分的結(jié)果，我們認(rèn)為：低氧能誘導(dǎo)循環(huán)CXCR4~+／PDGFRβ~+的SPCs歸巢至肺無肌細(xì)動脈并促進(jìn)歸巢的SPCs表達(dá)myocardin；在myocardin的介導(dǎo)下歸巢的SPCs進(jìn)而分化為VSMC。該過程可能在低氧性肺無肌細(xì)動脈的肌化過程中起重要作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號】：R363;R543.2

【引證文獻(xiàn)】

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本文編號：1401887