本文關(guān)鍵詞：睪丸抗原OY-TES-1羧基端截短蛋白的制備及鑒定　出處：《廣西醫(yī)科大學(xué)》2009年碩士論文　論文類(lèi)型：學(xué)位論文

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【摘要】： 目的:構(gòu)建OY-TES-1羧基端截短蛋白(OY-TES-1-C)重組質(zhì)粒、體外表達(dá)OY-TES-1-C蛋白,對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行純化和鑒定,為OY-TES-1后續(xù)研究奠定基礎(chǔ)。 方法:(1)提取人睪丸組織總RNA,逆轉(zhuǎn)合成cDNA;(2)擴(kuò)增OY-TES-1羧基末端253(S291-G543)個(gè)氨基酸的cDNA序列;(3)將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物插入原核表達(dá)載體pMAL-C2,構(gòu)建pMAL-C2-OY-TES-1-C重組質(zhì)粒,并轉(zhuǎn)化DH5α菌進(jìn)行pMAL-C2-OY-TES-1-C重組質(zhì)粒擴(kuò)增;(4)通過(guò)藍(lán)白斑篩選、DNA測(cè)序篩出正確的pMAL-C2-OY-TES-1-C重組質(zhì)粒,將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化Rosetta菌;(5)用IPTG對(duì)重組菌進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá),優(yōu)化IPTG使用的濃度和加入時(shí)機(jī),以及誘導(dǎo)溫度和誘導(dǎo)時(shí)間;(6)在優(yōu)化條件下表達(dá)融合蛋白MBP-OY-TES-1-C,通過(guò)Amylose-resin親和層析柱純化;(6)將純化后的MBP-OY-TES-1-C蛋白進(jìn)行Western Blot鑒定。 結(jié)果:重組質(zhì)粒pMAL-C2-OY-TES-1-C測(cè)序與已知序列相同;成功誘導(dǎo)表達(dá)出融合蛋白MBP-OY-TES-1-C。確定了pMAL-C2- OY-TES-1-C體外表達(dá)的優(yōu)化條件:37℃振蕩培養(yǎng)3小時(shí),加入IPTG(終濃度為0.7mmol/L),然后在32℃振蕩培養(yǎng)4小時(shí);表達(dá)出與預(yù)計(jì)分子量符合的融合蛋白。 結(jié)論:成功構(gòu)建了pMAL-C2-OY-TES-1-C重組質(zhì)粒,通過(guò)E.coli表達(dá)出MBP-OY-TES-1-C融合蛋白。
[Abstract]:Objective: to construct OY-TES-1 carboxy terminal truncated protein (OY-TES-1-C) recombinant plasmid, express OY-TES-1-C protein in vitro, and purify and identify the expressed product, so as to lay the foundation for subsequent research of OY-TES-1.
Methods: (1) total RNA was extracted from human testicular tissue, the reversal of the synthesis of cDNA; (2) amplification of OY-TES-1 carboxyl terminal 253 amino acid sequence of cDNA (S291-G543); (3) the PCR gene fragment was inserted into the prokaryotic expression vector pMAL-C2 to construct the recombinant plasmid of pMAL-C2-OY-TES-1-C, were amplified and recombinant plasmid pMAL-C2-OY-TES-1-C into E.coli DH5 (; 4) by blue white screening, the recombinant pMAL-C2-OY-TES-1-C plasmid DNA sequencing to screen out correctly, the recombinant plasmid was transformed into Rosetta bacteria; (5) the recombinant strain was induced and expressed by IPTG, IPTG and the use of optimal concentration and adding time, induction temperature and time; (6) under the optimized conditions the expression of fusion protein MBP-OY-TES-1-C. Purified by Amylose-resin affinity chromatography; (6) the purified MBP-OY-TES-1-C protein by Western Blot identification.
Results: the recombinant plasmid pMAL-C2-OY-TES-1-C sequencing with the known sequence of the same; expression of MBP-OY-TES-1-C. fusion protein to determine the optimal conditions of expression of pMAL-C2- OY-TES-1-C in vitro: 37 DEG C for 3 hours, adding IPTG (final concentration 0.7mmol/L), and then cultured for 4 hours at 32 DEG C oscillation; express with the expected molecular weight of the fusion protein with.
Conclusion: the recombinant plasmid of pMAL-C2-OY-TES-1-C was successfully constructed and the MBP-OY-TES-1-C fusion protein was expressed through E.coli.

【學(xué)位授予單位】：廣西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類(lèi)號(hào)】：R392

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本文編號(hào)：1397600