本文關(guān)鍵詞：Hes1和Mash1基因在脊髓源神經(jīng)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為膽堿能神經(jīng)元過程中表達(dá)的研究　出處：《山西醫(yī)科大學(xué)》2009年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】： 研究背景:神經(jīng)干細(xì)胞作為一種具有自我更新、增殖和可以定向分化為神經(jīng)元、星型膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞能力的細(xì)胞,不僅打破了中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育成熟后不可再生的理論,還為神經(jīng)系統(tǒng)損傷修復(fù)和退行性病變的治療提供了新的思路[1]。對于神經(jīng)干細(xì)胞的研究,是以保持體外培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞具有活躍的增殖能力為基礎(chǔ)的。同時(shí),中樞神經(jīng)系統(tǒng)各種不同的疾病大多是由于表型和功能不同的神經(jīng)元病變所致,然而許多研究表明如果將神經(jīng)干細(xì)胞直接移植于受損區(qū),則分化成所需的特異性神經(jīng)元將很少,難以發(fā)揮功能效應(yīng)。神經(jīng)干細(xì)胞的分化是一個(gè)復(fù)雜的多因素參與的過程,對于膽堿能神經(jīng)元的體外分化條件和機(jī)制的研究目前尚未達(dá)成共識(shí)。 目的:本部分的研究旨在通過對神經(jīng)干細(xì)胞的分離培養(yǎng),觀察研究其基本生物學(xué)特性,了解其增殖分化和體外培養(yǎng)獲得大量擴(kuò)增的條件,為進(jìn)一步研究神經(jīng)干細(xì)胞的定向分化奠定基礎(chǔ)。在體外環(huán)境下誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞向膽堿能神經(jīng)元分化,探討神經(jīng)干細(xì)胞的體外分化條件及誘導(dǎo)分化機(jī)制。 方法:將孕齡17 d的胚胎大鼠脊髓組織制備成單細(xì)胞懸液,接種到限定性無血清培養(yǎng)液中培養(yǎng),待形成原代克隆球后傳代擴(kuò)增。對第3代的神經(jīng)干細(xì)胞球進(jìn)行神經(jīng)上皮干細(xì)胞蛋白(Nestin)免疫熒光檢測。然后,將神經(jīng)干細(xì)胞克隆球接種到內(nèi)置多聚賴氨酸包被的蓋玻片的6孔培養(yǎng)板中,應(yīng)用誘導(dǎo)因子RA、SHH、NT-3和BDNF對神經(jīng)干細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)分化。在37℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中分化兩周后,用免疫熒光檢測膽堿能神經(jīng)元特異性標(biāo)志物膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶(ChAT)的表達(dá)。 結(jié)果:獲得了大量能自我增殖,表達(dá)Nestin,并可在體外長期維持穩(wěn)定狀態(tài)的神經(jīng)干細(xì)胞。神經(jīng)干細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)因子誘導(dǎo)1 w后,可見分化的細(xì)胞呈典型的神經(jīng)元樣細(xì)胞形態(tài):胞體飽滿而不規(guī)則,有多個(gè)細(xì)長突起;誘導(dǎo)2 w后,神經(jīng)細(xì)胞之間形成了網(wǎng)絡(luò)狀結(jié)構(gòu),免疫熒光檢測,ChAT陽性率達(dá)20%。 結(jié)論:從大鼠胚胎脊髓組織中分離得到的細(xì)胞具有不斷增殖和自我更新能力,并具有分化為神經(jīng)元的潛能。SHH、RA、NT-3和BDNF的共誘導(dǎo)可以誘導(dǎo)脊髓源性神經(jīng)干細(xì)胞在體外分化為膽堿能神經(jīng)元。 研究背景:神經(jīng)干細(xì)胞的生長和發(fā)育過程的調(diào)控涉及多個(gè)方面,包括神經(jīng)細(xì)胞特性的決定、細(xì)胞數(shù)量的控制,細(xì)胞分化的格局化和空間控制等。眾多基因家族參與了該過程,其中bHLH家族的Hes1和Mash1基因,作為神經(jīng)發(fā)育的相關(guān)基因,廣泛表達(dá)于發(fā)育中的中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)。Hes基因?qū)儆谪?fù)調(diào)控型的bHLH轉(zhuǎn)錄因子,在維持神經(jīng)干細(xì)胞增殖,使大腦細(xì)胞具有正確的數(shù)目、形態(tài)和細(xì)胞排列等方面具有重要的作用。正調(diào)控型轉(zhuǎn)錄因子Mash1基因,則有促進(jìn)神經(jīng)前體細(xì)胞向神經(jīng)元分化作用。正調(diào)控型和負(fù)調(diào)控型bHLH轉(zhuǎn)錄因子之間的彼此調(diào)控,共同調(diào)控著神經(jīng)干細(xì)胞的分化并且決定著其分化方向。本實(shí)驗(yàn)通過體外誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞向膽堿能神經(jīng)元分化,觀察Hes1和Mash1基因的表達(dá)變化,了解它們在神經(jīng)干細(xì)胞定向分化為膽堿能神經(jīng)元過程中發(fā)揮的作用。 目的:通過檢測胚胎大鼠脊髓源性神經(jīng)干細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化為膽堿能神經(jīng)元過程中Hes1和Mash1基因的表達(dá)變化,探討神經(jīng)干細(xì)胞的定向分化機(jī)制。方法:取體外培養(yǎng)的第三代的神經(jīng)干細(xì)胞,接種于內(nèi)置多聚賴氨酸包被過的蓋玻片的6孔培養(yǎng)板中,通過在培養(yǎng)基中添加誘導(dǎo)因子RA、SHH、NT-3和BDNF,誘導(dǎo)其向膽堿能神經(jīng)元分化。應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)分析神經(jīng)干細(xì)胞及向膽堿能神經(jīng)元誘導(dǎo)分化1 w和2 w時(shí), Hes1、Mash1和Nestin基因的表達(dá)變化。結(jié)果:Hes1、Mash1和Nestin mRNA在神經(jīng)干細(xì)胞分化前后表達(dá)有變化,誘導(dǎo)1 w時(shí)各基因均較對照組表達(dá)下降,誘導(dǎo)2 w時(shí)表達(dá)較誘導(dǎo)1 w時(shí)增高,但低于對照組。 結(jié)論:Hes1、Mash1和Nestin參與了神經(jīng)干細(xì)胞向膽堿能神經(jīng)元的分化過程,并且發(fā)揮了重要的作用。
[Abstract]:Background: neural stem cells as a self-renewal, proliferation and can differentiate into neurons, astrocytes and oligodendrocytes ability of the cells, not only broke the theory of non renewable development of central nervous system after maturity, provides a new way for [1]. neural stem cell research for nervous system damage and repair degenerative disease treatment, is to maintain the in vitro cultured neural stem cells with active proliferation as the foundation. At the same time, the central nervous system is mostly due to various diseases caused by neuron disease phenotype and function of different, but many studies show that if the neural stem cells transplanted directly in the damaged area. It differentiated into specific neurons required is small, it is difficult to play. The functional effect of neural stem cell differentiation is a complex process involved in many factors, for bravery The study of the conditions and mechanisms of the differentiation of alkaline energy neurons in vitro has not yet reached a consensus.
Objective: To study this part through separation of neural stem cell culture, observation and Study on its biological characteristics, understand the proliferation and differentiation of cultured in vitro in the amplification conditions, lay the foundation for further studying on the differentiation of neural stem cells in inducing neural stem cells differentiating into cholinergic neurons in vitro under the environment of in vitro differentiation of neural stem cells and differentiation conditions.
Methods: the gestational age of 17 D of embryonic spinal cord tissue of rats were prepared into single cell suspension was inoculated into the culture medium defined serum-free culture, to form the primary cloning ball passage amplification. The third generation of neural stem cells to neural stem cell (Nestin) immunofluorescence detection. Then, the neurospheres were inoculated into the 6 Hole built-in poly lysine coated coverslip culture plate, induced by factor RA, SHH, NT-3 and BDNF to induce the differentiation of neural stem cells. At 37 degrees, 5%CO2 saturated humidity incubator in two weeks after differentiation, with immune fluorescence detection of cholinergic neuron specific markers of choline acetyltransferase (ChAT) expression.
Results: to obtain a large number of self proliferation, Nestin expression, and in vitro to maintain long-term stable state of neural stem cells. Neural stem cells by inducing differentiation after 1 W visible cells showed the typical neuron like cell morphology: cell body plump and irregular, a plurality of elongated protrusions; induced by 2 W after the network structure formed between nerve cells, immunofluorescence, ChAT positive rate was 20%.
Conclusion: the cells isolated from rat embryonic spinal cord have the ability of continuous proliferation and self-renewal, and have the potential to differentiate into neurons..SHH, RA, NT-3 and BDNF co induction can induce spinal cord derived neural stem cells to differentiate into cholinergic neurons in vitro.
Background: regulation of neural stem cell growth and development process involves many aspects, including the characteristics of neural cells decision, control cell number, cell differentiation pattern and space control. Many gene family is involved in the process, the bHLH family of Hes1 and Mash1 genes, as neural development related genes. The bHLH transcription factors are expressed in the development of the central and peripheral nervous system.Hes gene belongs to the type of negative regulation, in maintaining the proliferation of neural stem cells, brain cells have the correct number, shape and arrangement of cells and other aspects have important role. Positive regulation type transcription factor Mash1 gene can promote neural precursor the role of cells to differentiate into neurons. Positive and negative regulation regulation each other between regulatory bHLH transcription factors, CO regulated the differentiation of neural stem cells and their differentiation determines the direction through this experiment. The differentiation of neural stem cells into cholinergic neurons was induced in vitro. The expression of Hes1 and Mash1 genes were observed, and their roles in the differentiation of neural stem cells into cholinergic neurons were observed.
Objective: through the spinal cord derived neural stem cells of embryonic rat detection differentiated into cholinergic Mash1 neurons and expression of Hes1 gene in the process, to explore the differentiation of neural stem cells. Methods: in vitro cultured neural stem cells of the third generation, the 6 hole with built-in poly-L-lysine the coverslip culture plate, the medium added RA SHH NT-3, inducing factor, and BDNF induced neuronal differentiation into cholinergic. Analysis of neural stem cells and differentiation to cholinergic neurons induced by 1 W and 2 W, Hes1 using real-time PCR technique. The expression of Mash1 and Nestin gene results: Hes1, Mash1 and Nestin in mRNA cell differentiation and expression changes of neural stem induced by 1 W genotypes were higher than those in control group decreased 2 W induced increased expression is induced by 1 W, but lower than the control group.
Conclusion: Hes1, Mash1 and Nestin participate in the differentiation process of neural stem cells to cholinergic neurons and play an important role.

【學(xué)位授予單位】：山西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號(hào)】：R329

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本文編號(hào)：1396998