本文關(guān)鍵詞：天然人源噬菌體抗體庫的構(gòu)建與初步篩選　出處：《北京生物制品研究所》2009年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

  更多相關(guān)文章： 噬菌體展示技術(shù) 人源基因工程抗體 Cre-Loxp重組

【摘要】： 將抗體的多樣性可變區(qū)基因組裝到表達(dá)載體內(nèi),表達(dá)到噬菌體表面,得到多樣性噬菌體抗體的集合即為噬菌體抗體庫。這一技術(shù)基于噬菌體表面展示技術(shù)的發(fā)展,相比較于多克隆抗體血清和B細(xì)胞雜交瘤技術(shù),帶來了抗體工程技術(shù)的一次巨大革命。它不僅解決了人源抗體制備的問題,更使得對抗體性能的改良進(jìn)入了新階段,可以篩選出具有特定性能的未知結(jié)構(gòu)。其中,大容量通用性噬菌體抗體庫的構(gòu)建和篩選技術(shù)的不斷改進(jìn),為高通量快速篩選特異性抗體提供了簡便和高效的可操作系統(tǒng),使得不經(jīng)免疫既可獲得各種特異性抗體。 噬菌體抗體庫分為合成抗體庫、半合成抗體庫以及天然庫(免疫或非免疫庫)。免疫抗體庫的抗體基因來自于經(jīng)抗原免疫的個(gè)體,易于獲得針對該特定抗原的抗體克隆,這類文庫具有較強(qiáng)的抗原特異性和親和力。相比較于免疫庫,更為理想的是構(gòu)建無免疫偏向性的抗體庫,可以同時(shí)針對多種人類抗原進(jìn)行篩選。通過收獲分離正常人外周血淋巴細(xì)胞、脾細(xì)胞、骨髓細(xì)胞中的mRNA,擴(kuò)增抗體基因并克隆到噬菌體載體后形成的天然非免疫性通用性抗體庫含有大量識別不同抗原的抗體克隆。與B細(xì)胞雜交瘤技術(shù)和免疫文庫相比,其具有許多優(yōu)點(diǎn):包含巨大數(shù)量的多樣性的抗體克隆;可以分離出針對那些不引起機(jī)體免疫反應(yīng)的弱抗原、自身抗原和具有毒性抗原的抗體;一個(gè)抗體庫可以用于多種抗原篩選而獲得多種抗體產(chǎn)生;在庫容量足夠大的時(shí)候可以獲得高親和力抗體。但是非免疫庫也存在一些局限性:在庫容量較小時(shí)分離到低親和力抗體;構(gòu)建抗體庫時(shí)間此較長;抗體庫的質(zhì)量和大小受可變區(qū)基因表達(dá)情況的影響;B細(xì)胞捐贈者的免疫歷史不清楚和IgM庫潛在多樣性的限制。 本研究利用噬菌體抗體庫技術(shù)和Cre-Loxp定位重組系統(tǒng),構(gòu)建了一個(gè)大容量天然噬菌體抗體庫,用眼睛蛇毒和HCV抗原分別對噬菌體抗體庫進(jìn)行篩選以獲得人源抗體。為構(gòu)建具有良好多樣性的抗體庫,我們采集了150份正常人的外周血,分離淋巴細(xì)胞,提取細(xì)胞總RNA反轉(zhuǎn)錄cDNA,分別以不同的人源抗體基因引物擴(kuò)增抗體輕重鏈基因。首先將輕鏈基因按照人類抗體基因使用頻率的比例混和(K:60%λ:40%HVK1:19.2%HVK2:10.2%HVK3:30.6%HVL1:14.8%HVL2:13.2%HVL3:9.2%),插入到pDF質(zhì)粒中,通過多次電轉(zhuǎn)化,鋪板刮細(xì)菌收獲含有輕鏈庫質(zhì)粒,然后將重鏈按照人類抗體基因使用頻率的比例(HVH1:38%HVH2:34%HVH3:2%HVH4:26%),混合后插入輕鏈質(zhì)粒獲得含有8.8×10~8克隆的初級非免疫抗體庫。 初級噬菌體抗體庫以高感染復(fù)數(shù)(MOI＞100:1)感染能分泌重組酶的大腸桿菌BS1365,使多個(gè)噬菌體同時(shí)感染一個(gè)細(xì)菌,低溫誘導(dǎo)定點(diǎn)重組,收獲的重組噬菌體抗體庫以低感染復(fù)述(MOI＜1:1)感染大腸桿菌XL1-Blue,噬菌體的基因型和表型得到統(tǒng)一,收獲噬菌體獲得含有9×10~(10)克隆的噬菌體抗體庫,隨機(jī)挑取10個(gè)克隆鑒定,輕鏈和重鏈均有插入的8個(gè)克隆,插入率為80%。隨機(jī)挑選96個(gè)克隆測序,獲得的序列結(jié)果表明沒有重復(fù)的序列,序列分析表明輕重鏈各亞型分布基本符合人類抗體基因使用頻率的比例。 用HCV NS4和Cobra venom對天然庫進(jìn)行了4輪富集篩選,4輪富集篩選的富集效果明顯。隨機(jī)挑選4輪富集篩選后的單克隆誘導(dǎo)表達(dá)后的上清進(jìn)行初步檢測。隨機(jī)挑選4輪富集篩選后的單克隆誘導(dǎo)表達(dá)后的上清進(jìn)行初步檢測。用96孔板進(jìn)行高通量的克隆篩選,獲得了20株具有Fab活性的抗體克隆,1株特異性的針對HCV NS4,一株針對Cobra venom,篩選結(jié)果并不理想,還需要進(jìn)一步調(diào)整實(shí)驗(yàn)條件來獲得特異性的抗體克隆。 本研究利用噬菌體抗體庫技術(shù),采集多份正常健康人外周血利用Cre-Loxp定位重組系統(tǒng),構(gòu)建了大容量的天然噬菌體抗體庫并對抗體庫的序列分布進(jìn)行了分析;并用眼鏡蛇毒和HCV抗原,對抗體庫進(jìn)行初步篩選,獲得了20株具有Fab活性的抗體克隆,1株特異性的針對眼鏡蛇毒抗原,1株特異性的針對HCV抗原,但獲得的抗體的反應(yīng)值較低,有必要對抗體庫進(jìn)行進(jìn)一步的改進(jìn)和調(diào)整篩選的方法和條件。
[Abstract]:This technique is based on the development of phage surface display technology . This technique is based on the development of phage surface display technology . This technique is based on the development of phage surface display technology . It has brought about a great revolution of anti - body engineering technology . It not only solves the problem of human antibody preparation , but also makes it possible to filter out the unknown structure with specific properties . A phage antibody library is divided into a synthetic antibody library , a semi - synthetic antibody library and a natural library ( immune or non - immune library ) . The antibody gene of the immune antibody library is derived from an individual immunized with an antigen and is easy to obtain an antibody clone aiming at the specific antigen . In order to construct an antibody library with good diversity , we collected 150 normal human peripheral blood , isolated lymphocytes , extracted the total RNA reverse transcribed cDNA of human antibody , and then inserted into the pDF plasmid . Then , the heavy chain was inserted into pDF plasmid . Then the heavy chain was inserted into the pDF plasmid . Then the heavy chain was inserted into pDF plasmid . Then the heavy chain was inserted into pDF plasmid . Then the heavy chain was inserted into the plasmid of human antibody gene ( HVH1 : 38 % HVH2 : 34 % HVH3 : 2 % HVH4 : 26 % ) . Then the light chain plasmid was inserted into the light chain plasmid to obtain the primary non - immune antibody library containing 8.8 脳 10 ~ 8 clones . coli XL1 - Blue was infected with a phage antibody library containing 9 脳 10 ~ ( 10 ) clones . The recombinant phage antibody library with 9 脳 10 ~ ( 10 ) clones was obtained by random selection of 96 clones . The results showed that there were no repeated sequences , and the sequence analysis showed that the distribution of each sub - subtype of heavy chain was basically in accordance with the frequency of human antibody gene use . Four rounds of enrichment and screening were carried out with HCV NS4 and Cobra venom , and the enrichment effect of 4 rounds of enrichment and screening was obvious . The supernatant after 4 rounds of enrichment and screening was selected randomly . In this study , using phage antibody library technique , a large - capacity natural phage antibody library was collected and the sequence distribution of the antibody library was analyzed . The antibody library was preliminarily screened by using Cobra venom and HCV antigen . One specific antibody clone with Fab activity was obtained . One specific antibody was specific for HCV antigen , but the antibody response was low , and it was necessary to further improve and adjust the antibody library .

【學(xué)位授予單位】：北京生物制品研究所
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號】：R392

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 趙慧斌;噬菌體抗體庫篩選技術(shù)[J];臨床檢驗(yàn)雜志;2004年02期

2 羅弋;龐華;李少林;曹輝;彭志平;;人源肺腺癌噬菌體抗體庫的構(gòu)建及篩選[J];第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào);2009年01期

3 汪治華;張國成;李安茂;周南;陳一;李小青;蘇宇飛;鄧陽彬;王治靜;;抗呼吸道合胞病毒Fab噬菌體抗體庫的構(gòu)建及初步篩選(英文)[J];中國當(dāng)代兒科雜志;2008年06期

4 汪治華;張國成;許東亮;孫新;李小青;李思袖;張學(xué)紅;聶曉晶;豆玉鳳;;抗呼吸道合胞病毒免疫噬菌體抗體庫的構(gòu)建及初步鑒定[J];細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志;2008年09期

5 原衛(wèi)清,王顥,呂卓人,陳萍,韓驊,牛利國;鈉泵抑制物噬菌體單鏈抗體庫的構(gòu)建[J];第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào);2001年14期

6 馬小兵;暢繼武;;噬菌體抗體庫技術(shù)[J];生物學(xué)通報(bào);2005年10期

7 陳穎;田朝偉;楊曉儀;賈宗劍;許健;黃少華;陳敏生;吳文言;;人源抗D-二聚體抗體的構(gòu)建和分析[J];免疫學(xué)雜志;2006年01期

8 田媛,胡寶成;體內(nèi)篩選技術(shù)在靶向治療中的新進(jìn)展[J];中國生物工程雜志;2004年11期

9 劉俊;全智勇;劉建華;;噬菌體展示技術(shù)篩選DNA錯(cuò)配修復(fù)蛋白MutS高親和性抗體[J];復(fù)旦學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2006年04期

10 柴蔚然;楊濤;胡曉年;牛勃;;噬菌體展示技術(shù)構(gòu)建重組人TNF-α單鏈抗體庫[J];上海交通大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2006年02期

相關(guān)會議論文 前10條

1 劉國振;劉斯奇;吳琳;;水稻抗體庫及基于抗體的蛋白質(zhì)組學(xué)[A];植物分子生物學(xué)與現(xiàn)代農(nóng)業(yè)——全國植物生物學(xué)研討會論文摘要集[C];2010年

2 陳志南;李玲;;基于抗體的生物制藥與轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究[A];第五次全國免疫診斷暨疫苗學(xué)術(shù)研討會論文匯編[C];2011年

3 栗利芳;索勛;盛僅滿;;伊氏錐蟲抗體庫的初步建立與效果檢測[A];中國動物學(xué)會第八次全國寄生蟲學(xué)學(xué)術(shù)討論會論文摘要匯編[C];2001年

4 夏錚;詹金彪;許林海;嚴(yán)志qq;王克夷;;利用噬菌體展示技術(shù)篩選模擬Gal-α1,3-Gal結(jié)構(gòu)的小肽[A];華東六省一市生物化學(xué)與分子生物學(xué)會2003年學(xué)術(shù)交流會論文摘要集[C];2003年

5 郭莉;湯永民;徐曉軍;沈紅強(qiáng);錢柏芹;羅春芳;;惡性淋巴瘤細(xì)胞cDNA T7噬菌體展示文庫的建立及意義[A];第七屆全國血液免疫學(xué)學(xué)術(shù)大會暨2008年浙江省血液病學(xué)術(shù)年會論文匯編[C];2008年

6 馮磊;金堅(jiān);陶文沂;張蓮芬;;白藜蘆醇抗腫瘤分子機(jī)制的探討[A];2006第六屆中國藥學(xué)會學(xué)術(shù)年會論文集[C];2006年

7 郭莉;湯永民;徐曉軍;沈紅強(qiáng);錢柏芹;羅春芳;;惡性淋巴瘤細(xì)胞cDNAT7噬菌體展示文庫的建立及意義[A];2007年浙江省兒科學(xué)、小兒外科學(xué)學(xué)術(shù)年會論文匯編[C];2007年

8 程訓(xùn)佳;楊彬;章黎;付永鋒;;入源抗IgE抗體的制備和研究[A];中華醫(yī)學(xué)會2011年全國變態(tài)反應(yīng)學(xué)術(shù)會議論文集[C];2011年

9 薛峰;鄭捷;潘萌;李衛(wèi)平;;鼠抗天皰瘡抗原(PVA)單鏈抗體的構(gòu)建與篩選[A];2002中國中西醫(yī)結(jié)合皮膚性病學(xué)術(shù)會議論文匯編[C];2002年

10 郭莉;湯永民;徐曉軍;沈紅強(qiáng);錢柏芹;羅春芳;;惡性淋巴瘤細(xì)胞cDNAT7噬菌體展示文庫的建立及意義[A];2007年浙江省血液病學(xué)術(shù)年會論文匯編[C];2007年

相關(guān)重要報(bào)紙文章 前10條

1 本報(bào)記者 王飛雁;義翹神州：做全球最大的抗體庫[N];北京日報(bào);2011年

2 徐彬;武大一博士論文造假疑云[N];南方周末;2003年

3 張木 魏于全;前進(jìn)中的我國生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)[N];科技日報(bào);2002年

4 本報(bào)記者 吳紅梅;江蘇開始參與“國際研發(fā)分工”[N];新華日報(bào);2010年

5 本報(bào)記者 楊田;我國可望成生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)聚寶盆[N];醫(yī)藥經(jīng)濟(jì)報(bào);2000年

6 記者汪敏華;申城建成首個(gè)抗體基因庫[N];解放日報(bào);2003年

7 湯宏;科海搏浪[N];解放軍報(bào);2000年

8 記者 生焰明 李玉成;防治內(nèi)毒血癥添“利器”[N];健康報(bào);2002年

9 記者 張學(xué)全;上海建成康復(fù)病人血液抗體基因庫[N];新華每日電訊;2003年

10 記者 駱紅初;隔離SARS與人體“第三者”露面 全球首個(gè)人源抗體基因庫建成[N];上海科技報(bào);2003年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 趙愛志;人源性肝癌單鏈抗體庫的構(gòu)建[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2002年

2 包國強(qiáng);利用導(dǎo)向選擇及噬菌體抗體庫技術(shù)制備人源性抗肝癌抗體[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2004年

3 王尚資;全合成人源抗體庫和人源化改型抗體庫的構(gòu)建及篩選[D];中國海洋大學(xué);2004年

4 焦永軍;人源Na（？）ve Fab抗體庫的構(gòu)建和抗Met抗體片斷的篩選及特征鑒定[D];南京醫(yī)科大學(xué);2005年

5 楊松川;從噬菌體展示抗體庫中篩選抗TSP50單鏈抗體及可溶性蛋白表達(dá)[D];吉林大學(xué);2006年

6 顧長國;抗巨細(xì)胞病毒人源化抗體的研究[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2005年

7 易國華;對蝦白斑病毒的侵染機(jī)制及其特異性單鏈抗體基因研究[D];武漢大學(xué);2004年

8 郭莉;一個(gè)新的白細(xì)胞膜抗原ZCH-2B8a編碼基因及其生物學(xué)特性的研究[D];浙江大學(xué);2006年

9 王玉娥;豬繁殖與呼吸綜合征病毒結(jié)構(gòu)蛋白抗原表位的分析[D];中國農(nóng)業(yè)大學(xué);2003年

10 石君帆;人源性噬菌體抗體庫與rhG-CSF基因工程ScFv抗體的研究[D];浙江大學(xué);2004年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 秦思遠(yuǎn);天然人源噬菌體抗體庫的構(gòu)建與初步篩選[D];北京生物制品研究所;2009年

2 馬巍娜;鹽酸克倫特羅單鏈抗體（scFv）的篩選與表達(dá)[D];中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院;2009年

3 汪治華;抗呼吸道合胞病毒免疫噬菌體抗體庫的構(gòu)建及初步鑒定[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2008年

4 許四宏;人源抗人類免疫缺陷病毒1型（HIV-1）結(jié)構(gòu)蛋白基因工程抗體的研究[D];中國藥品生物制品檢定所;2004年

5 劉U，

本文編號：1396380