本文關(guān)鍵詞：淋巴細胞主動免疫治療URSA的免疫效應(yīng)機制研究　出處：《廣州中醫(yī)藥大學(xué)》2013年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：目的： 研究淋巴細胞主動免疫治療不明原因反復(fù)自然流產(chǎn)(unexplained recurrent spontaneous abortion, URSA)的免疫效應(yīng)機制： 1.通過比較研究淋巴細胞主動免疫治療前后URSA患者血清中封閉抗體(blocking antibody, BA)水平的變化,探討淋巴細胞主動免疫治療URSA的體液免疫效應(yīng)機制； 2.通過比較研究淋巴細胞主動免疫治療前后URSA患者T細胞增殖功能的變化,探討淋巴細胞主動免疫治療URSA的細胞免疫效應(yīng)機制； 3.比較淋巴細胞主動免疫治療前后URSA患者Th17和Treg免疫細胞水平的變化,探討淋巴細胞主動免疫治療URSA的免疫調(diào)節(jié)細胞效應(yīng)機制； 4.尋找評價淋巴細胞主動免疫治療URSA有效與否的生物學(xué)標(biāo)記和檢測指標(biāo)。 方法： 1.淋巴細胞主動免疫治療URSA研究 選用URSA患者的配偶作為淋巴細胞供者,治療前供者應(yīng)先做乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、梅毒、HIV病毒篩查,如配偶篩查不合格則選用無血緣關(guān)系的健康第三方作為淋巴細胞供者,實驗室檢查要求同上。抽取供者靜脈血于肝素抗凝管中,無菌條件下分離出外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cells, PBMCs)洗滌2次后配成淋巴細胞濃度為(2～4)×107個/ml的生理鹽水懸液,于患者前臂皮下注射治療。 2.封閉抗體(BA)檢測 2.1補體依賴微量淋巴細胞毒試驗(complement-dependent cytotoxicity, CDC)檢測BA：抽取患者靜脈血并分離血清備用；抽取供者肝素抗凝靜脈血并分離出PBMC,用生理鹽水調(diào)整節(jié)細胞濃度至2×106個／ml。按操作說明先后分別加入供者PBMC、受者血清、兔補體到Terasaki微孔板對應(yīng)的各孔中(設(shè)置陰性對照和陽性對照),置于37℃孵育,然后加入FQAE熒光染料染色,于倒置相差顯微鏡下觀察細胞著色情況并計數(shù)。 2.2酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測BA：抽取URSA患者靜脈血,分離血清,使用ELISA檢測試劑盒并按說明書進行操作。設(shè)置陰性對照、陽性對照、空白對照。用酶標(biāo)儀讀取各孔0D值,判斷各孔反應(yīng)格局。 3.T淋巴細胞增殖功能檢測 抽取患者肝素抗凝靜脈血并分離出淋巴細胞,用細胞培養(yǎng)液調(diào)節(jié)細胞濃度至2×106個/ml。使用96孔細胞培養(yǎng)板,設(shè)置空白組、陰性對照組和實驗組,每組設(shè)3復(fù)孔。實驗組加植物血凝素PHA-P,空白組和陰性對照組不加。培養(yǎng)細胞72h,培養(yǎng)結(jié)束前4h,每孔加入CCK-8細胞增殖檢測試劑,繼續(xù)培養(yǎng)4h,使用酶標(biāo)儀讀取各孔0D值,計算細胞增殖指數(shù)。 4.患者Th17、Treg細胞數(shù)量檢測 制備患者淋巴細胞懸液并調(diào)整濃度至1×106個/ml,檢測Th17細胞時,使用白細胞激活劑刺激Th17細胞分泌IL-17,收集細胞后,經(jīng)洗滌、表面染色、固定、破膜、胞內(nèi)染色、洗滌、重懸等處理后,使用流式細胞儀進行檢測。實驗同時設(shè)置陰性對照和同型對照以調(diào)節(jié)補償并排除非特異性染色。 5.采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件對研究數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。率的比較使用卡方檢驗,兩樣本均數(shù)的比較使用t檢驗。 結(jié)果： 1.111例接受淋巴細胞主動免疫治療的患者全部再次妊娠,其中有19例再次發(fā)生早期自然流產(chǎn),其余92例繼續(xù)妊娠者中有81例孕周大于12周,所有接受治療的患者中未見有明顯的不良反應(yīng)者,治療成功率72.97%(81/111)。 2.CDC法檢測封閉抗體結(jié)果：36例患者治療前BA陽性3例,陰性33例,陽性率8.33%(3/36)；16例患者經(jīng)治療后BA陽性7例,陰性9例,陽性率43.75%(7/16)；兩組比較,治療后BA陽性率明顯高于治療前(x2=6.81(校正),P0.01)。 ELISA法檢測封閉抗體結(jié)果：24例患者治療前BA陽性1例,陰性23例,陽性率4.17%(1/24);34例患者治療后BA陽性25例,陰性9例,陽性率73.53%(25/34)：兩組比較,治療后BA陽性率明顯高于治療前(x2=27.37,P0.01)。 CDC法與ELISA法檢測BA的陽性率比較：所有采用CDC試驗檢測BA的52例患者中,陽性10例,陰性42例,陽性率為19.23%(10/52)；用ELISA法檢測BA的58例患者中,陽性26例,陰性32例,陽性率為44.83%(26/58)；兩種方法檢出BA的陽性率比較,ELISA法檢出BA的陽性率明顯高于CDC試驗(x2=8.16,P0.01),差異有統(tǒng)計學(xué)意義。 3.18例患者治療前T細胞增殖指數(shù)(SI)平均為1.56±0.25,20例患者治療后T細胞增殖指數(shù)平均為1.27±0.22,兩組比較,治療前患者T細胞增殖指數(shù)明顯高于治療后,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=3.80,P0.01)。 4.12例患者治療前CD4+IL-17A+Thl7比例平均2.63±0.64%,CD4+CD25+Foxp3'Treg比例平均3.78±0.76%,Th17/Treg比值平均0.70±0.11；19例治療后患者CD4+IL-17A+Th17比例平均1.75±0.59%,CD4'CD25'Foxp3'Treg比例平均3.86±0.88%,Thl7/Treg比值平均0.46±0.16。兩組比較,治療前患者CD4+IL-17A+Th17比例明顯高于治療后,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=3.92,P0.05)；治療后患者CD4+CD25+Foxp3+Treg比例與治療前相比,無統(tǒng)計學(xué)差異(t=0.26,P0.05)；而治療前Thl7/Treg比值明顯高于治療后Th17/Treg比值(t=4.55,P0.05)差異有統(tǒng)計學(xué)意義。 結(jié)論： 1.對URSA患者進行淋巴細胞主動免疫治療,可有效提高患者妊娠成功率,減少復(fù)發(fā)流產(chǎn)的風(fēng)險。 2.淋巴細胞主動免疫治療可刺激URSA患者體內(nèi)產(chǎn)生封閉抗體,調(diào)節(jié)患者體液免疫功能,保證妊娠順利進行。 3.淋巴細胞主動免疫治療可下調(diào)URSA患者T淋巴細胞增殖功能,使妊娠得以繼續(xù),T淋巴細胞介導(dǎo)的免疫效應(yīng)可能在URSA的發(fā)病機制和主動免疫治療效應(yīng)中起重要作用。 4.淋巴細胞主動免疫治療可使不利于妊娠的Thl7細胞減少,使Thl7/Treg比值降低,有效調(diào)節(jié)URSA患者體內(nèi)Th17/Treg平衡,改善患者的細胞免疫功能,使其轉(zhuǎn)向有利于妊娠的正常免疫狀態(tài)。 5.在封閉抗體檢測的方法學(xué)評估方面,ELISA試驗明顯優(yōu)于CDC試驗,使用ELISA方法檢測封閉抗體可作為判斷淋巴細胞主動免疫治療URSA有效與否的評估手段。
[Abstract]:Objective:
The immunologic effect mechanism of unexplained recurrent spontaneous abortion (URSA) in the treatment of unexplained recurrent spontaneous abortion by lymphocyte active immunization is studied.
1., by comparing the changes of blocking antibody (BA) level in serum of URSA patients before and after lymphocyte active immunotherapy, the humoral immune effect mechanism of lymphocyte active immunotherapy for URSA was discussed.
2., we compared the proliferation of T cells in URSA patients before and after lymphocyte active immunotherapy, and explored the mechanism of lymphocyte active immunotherapy for URSA.
3. to compare the changes of Th17 and Treg immune cells in URSA patients before and after active immunotherapy, and explore the immunoregulatory effect mechanism of lymphocyte active immunotherapy on URSA.
4. to find the biological markers and detection indexes for evaluating the effectiveness of URSA in the active immunotherapy of lymphocyte.
Method錛，

本文編號：1395859