本文關(guān)鍵詞：淋巴細(xì)胞主動(dòng)免疫治療URSA的免疫效應(yīng)機(jī)制研究　出處：《廣州中醫(yī)藥大學(xué)》2013年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：目的： 研究淋巴細(xì)胞主動(dòng)免疫治療不明原因反復(fù)自然流產(chǎn)(unexplained recurrent spontaneous abortion, URSA)的免疫效應(yīng)機(jī)制： 1.通過比較研究淋巴細(xì)胞主動(dòng)免疫治療前后URSA患者血清中封閉抗體(blocking antibody, BA)水平的變化,探討淋巴細(xì)胞主動(dòng)免疫治療URSA的體液免疫效應(yīng)機(jī)制； 2.通過比較研究淋巴細(xì)胞主動(dòng)免疫治療前后URSA患者T細(xì)胞增殖功能的變化,探討淋巴細(xì)胞主動(dòng)免疫治療URSA的細(xì)胞免疫效應(yīng)機(jī)制； 3.比較淋巴細(xì)胞主動(dòng)免疫治療前后URSA患者Th17和Treg免疫細(xì)胞水平的變化,探討淋巴細(xì)胞主動(dòng)免疫治療URSA的免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞效應(yīng)機(jī)制； 4.尋找評(píng)價(jià)淋巴細(xì)胞主動(dòng)免疫治療URSA有效與否的生物學(xué)標(biāo)記和檢測(cè)指標(biāo)。 方法： 1.淋巴細(xì)胞主動(dòng)免疫治療URSA研究 選用URSA患者的配偶作為淋巴細(xì)胞供者,治療前供者應(yīng)先做乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、梅毒、HIV病毒篩查,如配偶篩查不合格則選用無血緣關(guān)系的健康第三方作為淋巴細(xì)胞供者,實(shí)驗(yàn)室檢查要求同上。抽取供者靜脈血于肝素抗凝管中,無菌條件下分離出外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells, PBMCs)洗滌2次后配成淋巴細(xì)胞濃度為(2～4)×107個(gè)/ml的生理鹽水懸液,于患者前臂皮下注射治療。 2.封閉抗體(BA)檢測(cè) 2.1補(bǔ)體依賴微量淋巴細(xì)胞毒試驗(yàn)(complement-dependent cytotoxicity, CDC)檢測(cè)BA：抽取患者靜脈血并分離血清備用；抽取供者肝素抗凝靜脈血并分離出PBMC,用生理鹽水調(diào)整節(jié)細(xì)胞濃度至2×106個(gè)／ml。按操作說明先后分別加入供者PBMC、受者血清、兔補(bǔ)體到Terasaki微孔板對(duì)應(yīng)的各孔中(設(shè)置陰性對(duì)照和陽性對(duì)照),置于37℃孵育,然后加入FQAE熒光染料染色,于倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞著色情況并計(jì)數(shù)。 2.2酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)BA：抽取URSA患者靜脈血,分離血清,使用ELISA檢測(cè)試劑盒并按說明書進(jìn)行操作。設(shè)置陰性對(duì)照、陽性對(duì)照、空白對(duì)照。用酶標(biāo)儀讀取各孔0D值,判斷各孔反應(yīng)格局。 3.T淋巴細(xì)胞增殖功能檢測(cè) 抽取患者肝素抗凝靜脈血并分離出淋巴細(xì)胞,用細(xì)胞培養(yǎng)液調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度至2×106個(gè)/ml。使用96孔細(xì)胞培養(yǎng)板,設(shè)置空白組、陰性對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組,每組設(shè)3復(fù)孔。實(shí)驗(yàn)組加植物血凝素PHA-P,空白組和陰性對(duì)照組不加。培養(yǎng)細(xì)胞72h,培養(yǎng)結(jié)束前4h,每孔加入CCK-8細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑,繼續(xù)培養(yǎng)4h,使用酶標(biāo)儀讀取各孔0D值,計(jì)算細(xì)胞增殖指數(shù)。 4.患者Th17、Treg細(xì)胞數(shù)量檢測(cè) 制備患者淋巴細(xì)胞懸液并調(diào)整濃度至1×106個(gè)/ml,檢測(cè)Th17細(xì)胞時(shí),使用白細(xì)胞激活劑刺激Th17細(xì)胞分泌IL-17,收集細(xì)胞后,經(jīng)洗滌、表面染色、固定、破膜、胞內(nèi)染色、洗滌、重懸等處理后,使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照和同型對(duì)照以調(diào)節(jié)補(bǔ)償并排除非特異性染色。 5.采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)研究數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。率的比較使用卡方檢驗(yàn),兩樣本均數(shù)的比較使用t檢驗(yàn)。 結(jié)果： 1.111例接受淋巴細(xì)胞主動(dòng)免疫治療的患者全部再次妊娠,其中有19例再次發(fā)生早期自然流產(chǎn),其余92例繼續(xù)妊娠者中有81例孕周大于12周,所有接受治療的患者中未見有明顯的不良反應(yīng)者,治療成功率72.97%(81/111)。 2.CDC法檢測(cè)封閉抗體結(jié)果：36例患者治療前BA陽性3例,陰性33例,陽性率8.33%(3/36)；16例患者經(jīng)治療后BA陽性7例,陰性9例,陽性率43.75%(7/16)；兩組比較,治療后BA陽性率明顯高于治療前(x2=6.81(校正),P0.01)。 ELISA法檢測(cè)封閉抗體結(jié)果：24例患者治療前BA陽性1例,陰性23例,陽性率4.17%(1/24);34例患者治療后BA陽性25例,陰性9例,陽性率73.53%(25/34)：兩組比較,治療后BA陽性率明顯高于治療前(x2=27.37,P0.01)。 CDC法與ELISA法檢測(cè)BA的陽性率比較：所有采用CDC試驗(yàn)檢測(cè)BA的52例患者中,陽性10例,陰性42例,陽性率為19.23%(10/52)；用ELISA法檢測(cè)BA的58例患者中,陽性26例,陰性32例,陽性率為44.83%(26/58)；兩種方法檢出BA的陽性率比較,ELISA法檢出BA的陽性率明顯高于CDC試驗(yàn)(x2=8.16,P0.01),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 3.18例患者治療前T細(xì)胞增殖指數(shù)(SI)平均為1.56±0.25,20例患者治療后T細(xì)胞增殖指數(shù)平均為1.27±0.22,兩組比較,治療前患者T細(xì)胞增殖指數(shù)明顯高于治療后,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.80,P0.01)。 4.12例患者治療前CD4+IL-17A+Thl7比例平均2.63±0.64%,CD4+CD25+Foxp3'Treg比例平均3.78±0.76%,Th17/Treg比值平均0.70±0.11；19例治療后患者CD4+IL-17A+Th17比例平均1.75±0.59%,CD4'CD25'Foxp3'Treg比例平均3.86±0.88%,Thl7/Treg比值平均0.46±0.16。兩組比較,治療前患者CD4+IL-17A+Th17比例明顯高于治療后,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.92,P0.05)；治療后患者CD4+CD25+Foxp3+Treg比例與治療前相比,無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(t=0.26,P0.05)；而治療前Thl7/Treg比值明顯高于治療后Th17/Treg比值(t=4.55,P0.05)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)論： 1.對(duì)URSA患者進(jìn)行淋巴細(xì)胞主動(dòng)免疫治療,可有效提高患者妊娠成功率,減少?gòu)?fù)發(fā)流產(chǎn)的風(fēng)險(xiǎn)。 2.淋巴細(xì)胞主動(dòng)免疫治療可刺激URSA患者體內(nèi)產(chǎn)生封閉抗體,調(diào)節(jié)患者體液免疫功能,保證妊娠順利進(jìn)行。 3.淋巴細(xì)胞主動(dòng)免疫治療可下調(diào)URSA患者T淋巴細(xì)胞增殖功能,使妊娠得以繼續(xù),T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的免疫效應(yīng)可能在URSA的發(fā)病機(jī)制和主動(dòng)免疫治療效應(yīng)中起重要作用。 4.淋巴細(xì)胞主動(dòng)免疫治療可使不利于妊娠的Thl7細(xì)胞減少,使Thl7/Treg比值降低,有效調(diào)節(jié)URSA患者體內(nèi)Th17/Treg平衡,改善患者的細(xì)胞免疫功能,使其轉(zhuǎn)向有利于妊娠的正常免疫狀態(tài)。 5.在封閉抗體檢測(cè)的方法學(xué)評(píng)估方面,ELISA試驗(yàn)明顯優(yōu)于CDC試驗(yàn),使用ELISA方法檢測(cè)封閉抗體可作為判斷淋巴細(xì)胞主動(dòng)免疫治療URSA有效與否的評(píng)估手段。
[Abstract]:Objective:
The immunologic effect mechanism of unexplained recurrent spontaneous abortion (URSA) in the treatment of unexplained recurrent spontaneous abortion by lymphocyte active immunization is studied.
1., by comparing the changes of blocking antibody (BA) level in serum of URSA patients before and after lymphocyte active immunotherapy, the humoral immune effect mechanism of lymphocyte active immunotherapy for URSA was discussed.
2., we compared the proliferation of T cells in URSA patients before and after lymphocyte active immunotherapy, and explored the mechanism of lymphocyte active immunotherapy for URSA.
3. to compare the changes of Th17 and Treg immune cells in URSA patients before and after active immunotherapy, and explore the immunoregulatory effect mechanism of lymphocyte active immunotherapy on URSA.
4. to find the biological markers and detection indexes for evaluating the effectiveness of URSA in the active immunotherapy of lymphocyte.
Method錛，

本文編號(hào)：1395859