本文關(guān)鍵詞：與人巨細(xì)胞病毒UL23蛋白相作用的宿主蛋白分子篩選與鑒定　出處：《暨南大學(xué)》2009年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】： 目的：利用酵母雙雜系統(tǒng)來(lái)篩選與人巨細(xì)胞病毒蛋白pUL23相互作用的宿主蛋白,并通過(guò)GST-pull down和免疫共沉淀技術(shù)對(duì)蛋白之間的相互作用進(jìn)行確認(rèn),為進(jìn)一步研究病毒蛋白pUL23的功能奠定基礎(chǔ)。 方法：1)酵母雙雜交試驗(yàn)：以BAC-HCMV TOWNE為模板擴(kuò)增UL23基因的ORF序列,構(gòu)建pGBKT7-UL23誘餌質(zhì)粒,并擴(kuò)增人胚腎cDNA文庫(kù),通過(guò)共轉(zhuǎn)化酵母AH109進(jìn)行酵母雙雜交試驗(yàn),挑選長(zhǎng)勢(shì)良好的克隆100個(gè)進(jìn)行β-半乳糖苷酶活性檢測(cè),確定其為陽(yáng)性克隆,抽提陽(yáng)性克隆中的文庫(kù)質(zhì)粒,電轉(zhuǎn)化至大腸桿菌E.coli DH5α中擴(kuò)增,PCR文庫(kù)插入片斷,并進(jìn)行HaeⅢ酶切去重復(fù),然后將含有非重復(fù)片段的克隆送進(jìn)行測(cè)序,對(duì)測(cè)序結(jié)果在GenBank上進(jìn)行同源性搜索和序列比對(duì)分析。2)GST-pull down試驗(yàn)：以人胚腎cDNA文庫(kù)為模板,通過(guò)PCR方法擴(kuò)增人DNAJB6 [DnaJ (Hsp40) homolog, subfamily B, member 6(DNAJB6)]基因CDS,插入pGEX4-T-1載體中,IPTG誘導(dǎo)產(chǎn)生GST-DNAJB6融合蛋白；構(gòu)建pcDNA3.1(-)-HA-UL23質(zhì)粒,通過(guò)Cos-7細(xì)胞瞬時(shí)表達(dá),進(jìn)行GST-pull down試驗(yàn)檢測(cè)pUL23蛋白與人DNAJB6蛋白間的相互作用。3)免疫共沉淀試驗(yàn)：構(gòu)建pcDNA3.1(+)-HA-DNAJB6和pcDNA3.1(+)-Flag-UL23質(zhì)粒,共轉(zhuǎn)染Cos-7細(xì)胞,采用免疫共沉淀試驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證pUL23蛋白與人DNAJB6蛋白間的相互作用。 結(jié)果：酵母雙雜交試驗(yàn)得到79個(gè)陽(yáng)性克隆,其中一個(gè)克隆為人DNAJB6 [DnaJ (Hsp40) homolog, subfamily B, member 6 (DNAJB6)]基因。GST-pull down實(shí)驗(yàn)和免疫共沉淀試驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證pUL23能與人DNAJB6蛋白相互作用。 結(jié)論：本課題運(yùn)用酵母雙雜交系統(tǒng)篩選出與HCMV有相互作用的宿主蛋白DNAJB6,并通過(guò)GST-pull down和免疫共沉淀試驗(yàn)確認(rèn)其相互作用,試驗(yàn)結(jié)果將為進(jìn)一步研究pUL23蛋白在HCMV生活周期中的作用機(jī)制提供線索與依據(jù)。
[Abstract]:Objective : To screen the host protein interacting with human cytomegalovirus protein pUL23 by using yeast two - hybrid system , and confirm the interaction between proteins by GST - pull down and immune co - precipitation technique . Methods : 1 ) Yeast two - hybrid assay : Using BAC - HCMV TOWNE as template to amplify the ORF sequence of UL23 gene , construct pGBKT7 - UL23 bait plasmid , and amplify human embryo kidney cDNA library . The recombinant plasmid pcDNA3.1 ( + ) - HA - DNAJB6 and pcDNA3.1 ( + ) - Flag - UL23 plasmid were inserted into pGEX4 - T - 1 vector . Results : Seventy - nine positive clones were obtained from yeast two - hybrid test . One of them was the human DNA JB6 - DnaJ ( Hsp40 ) gene . The GST - pull down experiment and the immuno - co - precipitation test further verified that pUL23 could interact with the human DNA JB6 protein . Conclusion : The yeast two - hybrid system is used to screen the host protein DNAJB6 which interacts with HCMV , and its interaction is confirmed by GST - pull down and immune co - precipitation test . The experimental results will provide clues and basis for further study on the mechanism of pUL23 protein in HCMV life cycle .

【學(xué)位授予單位】：暨南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號(hào)】：R373

【引證文獻(xiàn)】

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1 肖靜;人巨細(xì)胞病毒基因組表達(dá)文庫(kù)的構(gòu)建及其應(yīng)用于病毒編碼蛋白相互作用的研究[D];暨南大學(xué);2011年

2 曾保娟;人巨細(xì)胞病毒蛋白pUL23影響宿主蛋白R(shí)ACK1與STAT1間的相互作用[D];暨南大學(xué);2012年

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本文編號(hào)：1388617