本文關鍵詞：小腸上皮分化相關microRNA的篩選　出處：《第三軍醫(yī)大學》2009年碩士論文　論文類型：學位論文

  更多相關文章： 小腸上皮 絨毛 隱窩 微小RNA 非編碼RNA 芯片 干細胞 分化 基因表達調(diào)控

【摘要】：在小腸組織中,單層柱狀上皮可向固有層折疊形成眾多的隱窩結構,同時也向腔面突起形成指狀的絨毛結構。在結腸只存在隱窩結構,大小和細胞組分在不同部位呈現(xiàn)不同。小腸上皮是個典型的干細胞分化系統(tǒng),多種祖細胞不斷分化成不同的細胞子系。關于腸上皮細胞持續(xù)的產(chǎn)生、分化的分子機制事關小腸疾病例如癌癥的發(fā)生、發(fā)展,所以已經(jīng)有廣泛研究。多條信號通路包括Notch和Wnt通路被認為在腸上皮細胞的增殖和分化調(diào)控中發(fā)揮重要作用。同時也提示上皮細胞的定向分化過程在基因表達的嚴格調(diào)控下。 微小RNA (MicroRNAs)是一類有20-25個核苷酸的非編碼RNA可以在多個物種中對基因的表達進行轉錄后調(diào)控。miRNA可通過和靶基因的mRNA序列部分互補來抑制它們的翻譯或者調(diào)解它們的穩(wěn)定性。miRNA可調(diào)控多個細胞事件,包括在器官發(fā)育和腫瘤形成中的細胞增殖分化事件。在本研究中,我們基于改良的腸上皮細胞分離方法,對腸上皮細胞分化相關的miRNA進行篩選。 目的: 1.建立改良的小腸上皮細胞低溫快速分離的方法 2.用miRNA芯片和Northern blot的方法篩選到腸上皮細胞分化相關的miRNA。 材料和方法: 1.腸道上皮的分離和富集 小腸上皮細胞的隱窩單位、絨毛單位以及結腸的隱窩單位在低溫條件下應用螯合劑進行洗脫和分離。上皮細胞間連接的保持和與基底膜的完整分離用收集細胞的HE切片來觀察。固有層來源的血細胞污染用CD45的免疫熒光染色來鑒定。 2.腸上皮細胞分化miRNA的篩選 小腸上皮的隱窩和絨毛細胞被分離和分別富集后進行RNA提取。18到100nt的小RNA從總RNA中進一步純化。經(jīng)過熒光標記,小RNA和miRNA芯片雜交得到小腸隱窩和絨毛細胞差異miRNA表達譜。對差異基因進行SAM和cluster分析處理。 3.對miRNA芯片的相關結果進行驗證 挑選6個隱窩和絨毛細胞間差異表達的miRNA用Northern Blot的方法進行驗證。 結果: 1.獲得了高純度的小腸上皮絨毛、隱窩細胞和結腸隱窩上皮細胞。小腸上皮絨毛、隱窩細胞和結腸隱窩上皮細胞在地位條件下被洗脫和富集。固有層腔面的基底膜保存完整。在上皮細胞富集物中偶見少量CD45表達陽性的造血系統(tǒng)來源細胞。 2.腸上皮細胞分化相關miRNA的篩選和隱窩細胞比較,35個miRNA在絨毛細胞中差異表達,其中16個上調(diào)的miRNA(倍數(shù)大于2)和19個下調(diào)的miRNA(倍數(shù)小于0.7).層次聚類樹通過cluster軟件生成。 3. miRNA芯片結果用Northern blot方法驗證。來源于小腸腸段,結腸腸段,去上皮的小腸腸段,小腸絨毛細胞,小腸隱窩和結腸隱窩細胞的RNA完整性保存良好。這些總RNA用來電泳和檢測6個挑選出來的差異表達miRNA。驗證結果顯示六個中有三個和芯片結果一致。相對于隱窩細胞,絨毛細胞上調(diào)miR-183,miR-31,下調(diào)miR-19-b。 結論: 1.我們成功的建立了改良性的小腸上皮和結腸上皮細胞的分離方法 2.我們獲得一系列腸上皮分化相關的miRNA候選分子。 3.我們確認了miR-143, miR-31, miR-22, miR-183, miR-17-5p和miR-19b在小腸和結腸的表達模式
[Abstract]:In the small intestine, columnar epithelium can form a recess structure of numerous folding to the natural layer, but also to the cavity surface protrusions formed to villus structure like. There is only in the colon crypt structure, size and cell components show different in different parts. The intestinal epithelial stem cell differentiation is a typical system, a variety of progenitor the cells continue to differentiate into different cell lines. The son of intestinal epithelial cells continue to produce, the molecular mechanism is related to the differentiation of the intestinal diseases such as cancer, development, so has been widely studied. Several signaling pathways including Notch and Wnt pathways are thought to play an important role in regulating the proliferation and differentiation of intestinal epithelial cells at the same time. Also suggested that strict regulation during directional differentiation of epithelial cells in gene expression.
Micro RNA (MicroRNAs) is a kind of non encoding RNA and 20-25 nucleotide can be in multiple species on gene expression of post transcriptional regulation by.MiRNA and the mRNA of target gene sequences complementary to suppress their translation or stability of.MiRNA they can mediate the regulation of multiple cellular events, including cell proliferation and differentiation events in the formation of organs and tumors. In this study, we modified the intestinal epithelial cells based on the separation method of intestinal epithelial cell differentiation related miRNA were screened.
Objective:
1. to establish a modified method for rapid isolation of small intestinal epithelial cells at low temperature
2. miRNA and Northern blot were used to screen the miRNA. related to the differentiation of intestinal epithelial cells
Materials and methods:
1. isolation and enrichment of intestinal epithelium
Intestinal epithelial cells crypt units, villus units and colon crypt units using chelating agents at low temperature were eluted and separated. The connection between the epithelial cells and maintain the integrity of the basement membrane for separation and collection of cell HE slice to observe. The inherent layer source of blood cells by immunofluorescence staining of CD45 pollution to identify.
Screening of 2. intestinal epithelial cell differentiation miRNA
Small intestinal villus and crypt cells were separated and enriched respectively after extraction of RNA.18 to 100nt RNA from the total RNA. After further purification of fluorescent markers, RNA and miRNA chip hybridization of small intestinal crypt and villus cells. Expression of miRNA spectrum of different gene SAM and cluster analysis.
3. verify the related results of miRNA chip
The differential expression of miRNA between 6 recess and villi cells was selected by Northern Blot.
Result:
1. obtain the high purity of the villi of small intestinal epithelium, crypt cells and colonic crypt epithelial cells. The intestinal epithelial villi, crypt cells and colonic crypt epithelial cells in position conditions were isolated and purified. The inherent layer cavity surface of basement membrane intact. I see in the epithelial cell enrichment in less expression of CD45 in cells of hematopoietic origin..
2., screening of intestinal epithelial differentiation related miRNA and comparison of crypt cells. 35 miRNA expressed differently in villous cells, of which 16 upregulated miRNA (multiple greater than 2) and 19 down regulated miRNA (multiple less than 0.7). Hierarchical clustering tree was generated by cluster software.
3. miRNA chip results using Northern blot method to verify. From the intestinal segment, colon segment, segment of small intestine to epithelium, intestinal villi cells, RNA integrity of the intestinal crypt and colonic crypt cells were well preserved. The expression of miRNA. results showed that three out of six results and chip electrophoresis and detection of the 6 selected consistent out of these differences to total RNA. Compared with the crypt cells, upregulation of villus cells miR-183, miR-31, down miR-19-b.
Conclusion:
1. we successfully established a method of separating the benign small intestinal epithelium from the colon epithelial cells.
2. we have obtained a series of miRNA candidate molecules associated with intestinal epithelial differentiation.
3. we confirmed the expression patterns of miR-143, miR-31, miR-22, miR-183, miR-17-5p, and miR-19b in the small intestine and colon

【學位授予單位】：第三軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2009
【分類號】：R346

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