本文關(guān)鍵詞：土撥鼠CTLA4的原核表達和多克隆抗體的制備　出處：《華中科技大學(xué)》2009年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：研究背景: 土撥鼠肝炎病毒(Woodchuck hepatitis virus,WHV)屬于嗜肝DNA病毒,與人乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)關(guān)系十分密切,在基因組結(jié)構(gòu)、病毒復(fù)制和病毒感染過程等方面都十分的相類似[1,2,3],是目前已知的用于研究乙肝病毒的致病機制和篩選新的抗病毒藥物,并且在研制新的疫苗中發(fā)揮重要作用的最理想小動物模型。目前各國學(xué)者對乙型肝炎病毒難以清除,如果機體缺乏有效的T細胞免疫會最終導(dǎo)致慢性化這一點是持一致和肯定意見的。注重于探討抗病毒反應(yīng)引起T細胞活化的相關(guān)因素在以往的研究中多有涉及,但是卻忽略了一個目前已經(jīng)逐漸認識到了的重要問題:負調(diào)節(jié)機制在抑制T細胞活化方面同樣發(fā)揮重要作用。近年來的許多研究表明乙肝感染程度除了與免疫反應(yīng)的強度有關(guān)之外,它同時又是一個被許多細胞因子相互調(diào)節(jié)的過程,這其中就包括細胞表面的受體CTLA4[4]。 在本研究中,通過分子克隆的手段成功將CTLA4構(gòu)建到原核表達載體中并在大腸桿菌BL21(DE3)進行誘導(dǎo)表達,并最終制備了多克隆抗體。這一實驗結(jié)果為進一步完善土撥鼠模型相關(guān)指標,檢測和研究CTLA4在正常、急性、慢性WHV中的表達,評估CTLA4在肝炎慢性化中的作用奠定一定的基礎(chǔ)。 目的 1.構(gòu)建土撥鼠CTLA4的原核表達載體并在大腸桿菌中進行表達。 2.制備了多克隆抗體,同時檢測土撥鼠CTLA4的特異性和靈敏性。 方法 1.應(yīng)用基因工程技術(shù)將土撥鼠的CTLA4的基因片段裝入原核表達載體,轉(zhuǎn)化表達菌后誘導(dǎo)目的蛋白的表達,應(yīng)用電洗脫方法純化目的蛋白,并用SDS-PAGE和Western blot對表達產(chǎn)物(目的蛋白)進行相應(yīng)鑒定。 2.用純化的目的蛋白免疫新西蘭大白兔制備多克隆抗體,并純化多克隆抗體。 結(jié)果 1.通過PCR鑒定、酶切鑒定,并在核酸測序后與CTLA4的原始序列比對,結(jié)果表明成功構(gòu)建土撥鼠CTLA4的原核表達載體。 2.用目的蛋白免疫新西蘭大白兔獲得多克隆抗體,采用酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA),Western blot等方法對多克隆抗體的靈敏度和特異性進行檢測。
[Abstract]:Research background:
Woodchuck hepatitis virus (Woodchuck hepatitis, virus, WHV) belongs to the hepatotropic DNA virus, and hepatitis B virus (Hepatitis B, virus, HBV) very close relationship, in the genomic structure, viral replication and virus infection and other aspects are very similar to [1,2,3], is currently known for the pathogenic mechanism of hepatitis B virus and screening of new antiviral drugs, the animal model and play an important role in the development of new vaccines. At present, many scholars are difficult to remove of the hepatitis B virus, if the body lacks the effective immune T cells will eventually lead to the chronicity of this point is consistent and positive opinion. Focus on the study of the antiviral response caused by there are factors involved in the activation of T cells than in previous studies, but it ignores an important problem which has been gradually aware of the negative regulation mechanism in the inhibition of T cells Also play an important role in activation. In recent years many studies show that the degree of hepatitis B infection in addition to the intensity of the immune reaction, it is also a lot of cytokines regulate each other processes, including the cell surface receptor CTLA4[4].
In this study, by means of molecular cloning CTLA4 successfully constructed into the prokaryotic expression vector in Escherichia coli BL21 (DE3) induced expression, and finally prepared the polyclonal antibody. The results of this experiment is to further improve the relevant index marmot rat model, detection and research of CTLA4 in normal, acute. The expression of WHV in chronic, laid the foundation for evaluation of CTLA4 in the chronic hepatitis.
objective
1. to construct the prokaryotic expression vector of woodchuck CTLA4 and expressed in Escherichia coli.
2. preparation of polyclonal antibody, simultaneous detection of woodchuck CTLA4 specificity and sensitivity.
Method
1. application of gene engineering technique of Marmot CTLA4 gene fragment into the prokaryotic expression vector for protein expression coli after the application of electrodialysis method to purify the protein, and use SDS-PAGE and Western to blot expression (protein) were identified.
2. purified to immunize New Zealand white rabbits to prepare polyclonal antibody, and purified polyclonal antibody.
Result
1. identified by PCR, enzyme digestion, and the original sequence alignment and CTLA4 in nucleic acid sequencing, the results indicated the successful construction of prokaryotic expression vector of woodchuck CTLA4.
2. to immunize rabbits to obtain polyclonal antibodies by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) detection, the sensitivity and specificity of Western blot method of polyclonal antibody.

【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號】：R373

【共引文獻】

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本文編號：1387777