本文關鍵詞：漢賽巴爾通體外膜蛋白質組學研究　出處：《中國疾病預防控制中心》2009年博士論文　論文類型：學位論文

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【摘要】： 貓抓病(cat-scratch disease,CSD)主要是由漢賽巴爾通體引起的人類新發(fā)人獸共患病。貓是這種巴爾通體的自然宿主,通過抓或咬傷將巴爾通體傳染給人,人感染這些細菌后在傷口處會出現紅斑丘疹或化膿性丘皰疹,繼而發(fā)生以局部淋巴結炎為典型癥狀的CSD,少數患者還可并發(fā)心內膜炎、桿菌性血管瘤、骨髓炎和腦膜炎等全身性疾病。人們對漢賽巴爾通體的致病機理和宿主的免疫保護機制還不十分清楚。本研究擬應用蛋白質組學和生物信息學的研究方法對漢賽巴爾通體外膜蛋白質組進行研究,篩選可能用于診斷和疫苗研制的候選蛋白,以及發(fā)現可能與細胞粘附、侵入及毒力相關的膜蛋白成分。 實驗根據外膜蛋白組分不能溶解在十二烷基肌氨酸鈉(簡稱SLS)和碳酸鈉(Na_2CO_3)溶液中的特性,用2種分離方法制備漢賽巴爾通體ATCC 49882 Houston-1株外膜蛋白樣品。采用雙向電泳(2-DE),即進行pH 3-10非線性IPG干膠條進行第一向等電聚焦電泳、12.5%凝膠第二向SDS-PAGE電泳、考馬斯亮藍G-250染色、圖像掃描及分析;比較上述2種方法制備的外膜蛋白樣品2-DE圖譜差異,并對不同裂解液溶解的蛋白樣品結果進行比較。在獲得SLS法和碳酸鈉法在外膜蛋白樣品制備中存在互補性的條件下,同時用兩種方法制備了另外3種致病性巴爾通體(伊麗莎白巴爾通體、文森巴爾通體博格霍夫亞種和格拉漢姆巴爾通體)的外膜蛋白樣品,進行2-DE實驗分析。應用SLS制備的蛋白樣品上樣量為600μg,獲得約368個蛋白質點,大量高豐度蛋白集中在pⅠ值4.3～6.5之間。等電點范圍為4.0～10.0,分子量范圍為15 kDa～150 kDa。其中大部分高豐度蛋白分布在pⅠ值5～6和8～9之間。應用碳酸鈉的蛋白樣品上樣量為800μg,獲得約471個蛋白質點,高豐度蛋白集中在pⅠ值5.0～6.3之間。等電點范圍為4.8～10.0,分子量范圍為10 kDa～180 KDa。在裂解液中增加ASB-14等兩性離子去污劑使蛋白樣品溶解性增強,檢出蛋白點增多,堿性端檢出蛋白點明顯增加。重復性實驗2種方法均獲得穩(wěn)定、一致的2-DE圖譜。 應用基質輔助激光解析-飛行時間質譜技術鑒定了上述2種方法檢出的全部蛋白點,并對鑒定的蛋白進行信號肽、亞細胞定位和結構域搜索等生物信息學分析。SLS法制備的樣品中鑒定出176點代表94種蛋白,外膜蛋白有6種;碳酸鈉法制備的樣品中鑒定出259點代表139種蛋白,外膜蛋白有9種;2種方法共鑒定出10種外膜蛋白,2種是本研究中首次證實存在的外膜蛋白,包括孔蛋白、血紅素結合蛋白、表面抗原蛋白、藥物排出相關蛋白和脂蛋白等。對漢賽巴爾通體基因組中預測出的外膜蛋白應用生物信息學方法初步預測結構和功能,結果發(fā)現43個外膜蛋白中與鐵離子吸收相關毒力因子有5個、細胞粘附相關的蛋白5個、溶血素4個、血凝素6個、自轉運蛋白7個、藥物外排相關蛋白2個、運輸相關蛋白2個、抵抗有機溶劑蛋白1個及一些與膜結構相關的蛋白;有2個細菌表面抗原蛋白,均已被分離鑒定出來,可能具有免疫保護性,需要進一步研究證實。 本研究建立了巴爾通體外膜蛋白2-DE技術,并發(fā)現兩種外膜蛋白樣品制備方法有一定的互補性,SLS法表現出對外膜上高表達的孔蛋白的富集,Na_2CO_3法對低豐度、堿性蛋白表現出較好的分離效果,為今后巴爾通體外膜蛋白質組研究提供了參考。新發(fā)現的蛋白提示巴爾通體可能存在藥物外排系統(tǒng),對抗菌藥物和耐藥機制產生的影響有待進一步研究。外膜蛋白的質譜鑒定及生物信息學分析提示在漢賽巴爾通體外膜上存在大量與細胞粘附、侵襲等致病相關的蛋白,對漢賽巴爾通體外膜蛋白質組的全面評估不僅對今后開展診斷和疫苗技術研究有重要意義,而且為巴爾通體致病機制研究指出了新的方向。
[Abstract]:Cat scratch disease (cat-scratch disease CSD) is mainly caused by the human body Han Sabar new zoonosis. The cat is the natural host Barr was caught by Barr, or will the bite of infected people, people infected with these bacteria erythema papules or purulent papulovesicles in the wound, and then to local lymphadenitis as the typical symptoms of CSD, a few patients can be complicated by endocarditis, bacillary angiomatosis, meningitis, osteomyelitis and other systemic disease. The immune protection mechanism of pathogenic mechanism of Han Sabar quintana and host is still unclear. This study intends to research methodology and biological information application of proteomics research of Han Sabar the outer membrane proteins may be used for screening, diagnosis and development of candidate protein vaccines, and that may be related to cell adhesion, invasion and virulence related membrane protein Ingredients.
According to the experiment of outer membrane protein components can not be dissolved in twelve alkyl sodium sarcosinate (SLS) and sodium carbonate (Na_2CO_3) properties in solution, with 2 kinds of separation methods of preparation of Han Sabar was ATCC 49882 Houston-1 strain. The outer membrane protein samples by two-dimensional electrophoresis (2-DE), which is in the pH 3-10 nonlinear IPG dry strip the first to the isoelectric focusing electrophoresis, gel electrophoresis of SDS-PAGE 12.5% to second, Kaumas Coomassie brilliant blue G-250 staining, scanning and image analysis; comparison of the above 2 methods of preparation of outer membrane protein 2-DE of different samples, and the different lysates of dissolved protein samples were compared. Results in SLS method and sodium carbonate method are complementary the conditions of the membrane protein in the sample preparation, and is prepared by two methods and 3 kinds of pathogenic Bartonella henselae (Elizabeth Barr, Vincent Hof and Graham Berg of Bartonella subspecies of Bartonella Body) of the outer membrane protein samples, analyzed by the 2-DE experiment. Protein sample preparation using SLS sample volume is 600 g, about 368 protein spots, a large number of high abundance proteins in P 1 ranged from 4.3 to 6.5. The isoelectric point ranged from 4 to 10, the range of molecular weight is 15 ~ kDa 150 kDa. most high abundance protein distribution in P I value 5 ~ 6 and 8 ~ 9. The application of sodium carbonate in protein sample was 800 g, about 471 protein spots, high abundance protein concentration in P I value 5 ~ 6.3. The isoelectric point ranged from 4.8 to 10. The molecular weight range of 10 kDa ~ 180 KDa. in lysis buffer increased ASB-14 zwitterionic detergent to protein samples enhances the solubility and protein detection point increased, alkaline end detection protein increased significantly. Repeatability of the 2 methods are stable, 2-DE of the same.
Using matrix assisted laser desorption time-of-flight mass spectrometry identification detection of the above 2 methods all proteins, and the proteins were signal peptide, subcellular localization and structure domain search and bioinformatics analysis of.SLS samples prepared by identified 176 representatives of 94 proteins, outer membrane protein of 6 samples; the preparation of sodium carbonate in the identified 259 points represent 139 proteins, outer membrane protein 9; 2 methods were identified 10 kinds of outer membrane protein, 2 is the first confirmed the presence of outer membrane proteins in this study, including hole protein, heme binding protein, protein, drug related protein and lipoprotein discharge for the application of Bioinformatics Method of outer membrane protein predicted in the genome of the Han Sabar school preliminary prediction of structure and function, results showed that the virulence factors and the iron absorption of 43 outer membrane proteins in 5, cell adhesion With related protein 5, hemolysin 4, 6 ha, 7 autotransporter proteins, drug efflux related protein 2, transport related protein 2, organic solvent resistance protein 1 protein and membrane structure and some related; there are 2 bacterial surface proteins have been isolated, identified it may have protective immunity, need further study.
This study established the Barr outer membrane protein 2-DE, and found that two kinds of membrane protein sample preparation method is complementary to each other, the SLS method showed enrichment of membrane porin foreign high expression of Na_2CO_3 on low abundance of basic protein showed a good separation effect, provide a reference for the future Barr quintana the outer membrane proteome research. The newly discovered protein that Barr the possible drug efflux system, further study on effect of antibiotics and resistance mechanism. Mass spectrometry and bioinformatics analysis of outer membrane protein in the outer membrane was that Han Sabar had a large number of cell adhesion, invasion and pathogenicity related protein, a comprehensive assessment of the Han Sabar, the outer membrane proteins not only for future development has an important significance in diagnosis and vaccine research technique, and to study the pathogenic mechanism of Barr was pointed out The new direction.

【學位授予單位】：中國疾病預防控制中心
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2009
【分類號】：R378

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本文編號：1384136