發(fā)布時間：2018-01-04 22:09

  本文關(guān)鍵詞：β-1，4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶-Ⅰ在大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥反應中的表達及意義　出處：《南通大學》2009年碩士論文　論文類型：學位論文

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【摘要】：目的:觀察β-1,4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶-I(β-1,4-galactosyltransferase-I,β-1,4-GalT-I)及其催化合成的Galβ1-4GlcNAc糖鏈在大鼠脊髓內(nèi)注射內(nèi)毒素(Lipopolysaccharide,LPS)致炎模型及大鼠大腦炓質(zhì)內(nèi)注射LPS致帕金森病(PD)模型中的表達情況及細胞定位,進一步明確炎癥刺激小膠質(zhì)細胞β-1,4-GalT-I表達上調(diào)的意義,并探討其在炎癥激活小膠質(zhì)細胞中的生物學作用。 方法:(1)應用SD大鼠脊髓內(nèi)注射LPS建立脊髓炎癥模型,利用實時熒光定量PCR(Real Time-PCR)檢測術(shù)后脊髓組織中β-1,4-GalT-I在mRNA水平的表達變化;免疫熒光檢測β-1,4-GalT-I及Galβ1-4GlcNAc糖鏈在脊髓內(nèi)注射LPS后的定位和細胞分布;利用免疫共沉淀檢測LPS對E-選擇素與β-1,4-半乳糖基化作用的影響;PCR檢測LPS對小膠質(zhì)細胞β-1,4-GalT-I表達的影響;應用ELISA檢測了脊髓內(nèi)注射LPS后TNF-α釋放情況;PCR檢測TNF-α對小膠質(zhì)細胞β-1,4-GalT-I表達的影響。(2)應用SD大鼠大腦炓質(zhì)內(nèi)注射LPS建立大鼠PD模型,分別利用Real Time-PCR、Western-blot、Lectin-blot、免疫熒光雙標法等方法觀察β-1,4-GalT-I及其催化合成的Galβ1-4GlcNAc糖鏈在術(shù)后炓質(zhì)中的表達情況及細胞定位。(3)應用胚胎SD大鼠中腦神經(jīng)元-膠質(zhì)細胞共培養(yǎng)建立體外PD模型,利用Western-blot觀察了LPS對共培養(yǎng)細胞β-1,4-GalT-I蛋白表達的影響;應用LPS或β-1,4-GalT-I抗體處理共培養(yǎng)細胞,免疫熒光和ELISA檢測共培養(yǎng)細胞中小膠質(zhì)細胞活化和吞噬作用。 結(jié)果:(1)大鼠脊髓內(nèi)注射LPS誘導脊髓中β-1,4-GalT-I mRNA表達上調(diào)。β-1,4-GalT-I mRNA的表達水平呈時間依賴性關(guān)系,在術(shù)后6-8h表達到達高峰;β-1,4-GalT-I蛋白水平和Galβ1-4GlcNAc糖鏈在術(shù)后24h達到高峰,主要是注射側(cè)灰質(zhì)和白質(zhì)表達增多,且這些分子主要定位于活化的小膠質(zhì)細胞、中性粒細胞、巨噬細胞。術(shù)后熒光雙標檢測到E-選擇素與Galβ1-4GlcNAc糖鏈共定位,運用免疫共沉淀進一步證實脊髓炎癥過程中E-選擇素與β-1,4-半乳糖基化作用增強。并且在脊髓炎癥中檢測到TNF-α表達增加。PCR顯示LPS或TNF-α刺激體外培養(yǎng)的小膠質(zhì)細胞,β-1,4-GalT-I mRNA的表達水平呈現(xiàn)劑量依賴性和時間依賴性關(guān)系。 (2)大鼠大腦炓質(zhì)內(nèi)注射LPS后,β-1,4-GalT-I mRNA表達出現(xiàn)上調(diào)趨勢,在術(shù)后8h達到高峰,之后表達逐漸下降到正常水平。Western-blot顯示β-1,4-GalT-I蛋白在炓質(zhì)內(nèi)注射LPS后2h即表達增加,持續(xù)至術(shù)后3 dβ-1,4-GalT-I蛋白表達仍較高, 3 d后表達降低;Galβ1-4GlcNAc糖鏈表達亦隨之升高,在術(shù)后12-24 hβ-1,4-半乳糖基化作用增強尤為明顯。此外,在大鼠PD病理過程中,β-1,4-GalT-I和Galβ1-4GlcNAc糖鏈主要定位于活化的小膠質(zhì)細胞。 (3)LPS誘導共培養(yǎng)細胞中β-1,4-GalT-I蛋白表達增加,作用8-18 h表達達到高峰,然后逐漸下降到正常水平。免疫熒光顯示LPS誘導共培養(yǎng)細胞中小膠質(zhì)細活化和吞噬功能增強,這一作用可以被β-1,4-GalT-I抗體減弱。ELISA結(jié)果表明β-1,4-GalT-I抗體影響LPS導致的TNF-α的釋放。 結(jié)論:(1)β-1,4-GalT-I及其催化合成的Galβ1-4GlcNAc糖鏈可能參與LPS所致的中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥反應,尤其可能在炎癥細胞向炎癥部位遷移這一過程中發(fā)揮重要作用。 (2)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥反應過程中,TNF-α可能參與β-1,4-GalT-I的表達變化。 (3)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥反應過程中,β-1,4-GalT-I可能參與介導小膠質(zhì)細胞的激活,從而在神經(jīng)退變性疾病發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用。
[Abstract]:Objective: To observe the -1,4- beta galactosyltransferase -I (beta -1,4-galactosyltransferase-I and beta -1,4-GalT-I) injection and catalytic synthesis of Gal beta 1-4GlcNAc sugar chain in the rat spinal cord induced by endotoxin (Lipopolysaccharide, LPS) LPS brain Liao Intraplasmic injection and inflammatory model of rats induced by Parkinson disease (PD) expression and cell localization model the further inflammation of microglia stimulated the expression of -1,4-GalT-I beta, and investigate its biological role in microglia activation in inflammation.
Methods: (1) the application of SD in the rat spinal cord with LPS to establish spinal cord inflammation model, using real-time fluorescence quantitative PCR (Real Time-PCR) expression of beta -1,4-GalT-I detection in spinal cord tissue after operation at the mRNA level; immunofluorescence detection of beta -1,4-GalT-I and Gal beta 1-4GlcNAc sugar chain positioning injection in the spinal cord after LPS and cell distribution co precipitation; detection of LPS effects and beta -1,4- galactosylation of E- by immune; PCR detection effect of LPS on the expression of microglia in beta -1,4-GalT-I; ELISA was used to detect the TNF- alpha release in the spinal cord after LPS injection; effect of PCR detection of TNF- alpha on the expression of microglia (beta -1,4-GalT-I. 2) application of SD rat brain Liao Intraplasmic injection LPS rats PD model, respectively, by Real Time-PCR, Western-blot, Lectin-blot, immunofluorescence method to observe the beta -1,4-GalT-I and its catalytic synthesis of Gal beta 1-4GlcNAc sugar After Liao chain in the expression and cellular localization. (3) the application of SD rat embryonic midbrain neurons and glial cells were cultured in vitro PD model, the effects of LPS co cultured cells beta -1,4-GalT-I protein expression by Western-blot; application of LPS or beta -1,4-GalT-I antibody treated cells co culture, immunofluorescence and detection of ELISA cells Co cultured microglia activation and phagocytosis.
Results: (1) upregulation of beta -1,4-GalT-I and mRNA expression in spinal cord in the spinal cord of rats induced by injection of LPS. The expression level of -1,4-GalT-I beta mRNA was time dependent relationship, reached the peak expression at 6-8h after operation; beta -1,4-GalT-I and Gal beta 1-4GlcNAc protein level in the sugar chain reached the peak at 24h after the injection side, is mainly gray and white the increased expression of these molecules and matter, mainly located in activated microglial cells, neutrophils and macrophages. After fluorescence double staining to E- selectin and Gal beta 1-4GlcNAc sugar chain co localization, further confirmed using immune E- selection of spinal cord inflammation process enhancement and beta -1,4- galactosylation Co precipitation. And in the spinal cord inflammation was detected in TNF- LPS or.PCR showed increased expression of alpha TNF- alpha stimulation in cultured microglia, the expression level of mRNA beta -1,4-GalT-I showed a dose-dependent and time-dependent manner.
(2) rat brain Liao Intraplasmic injection after LPS, the expression of -1,4-GalT-I beta mRNA appears upward trend, reaching a peak after 8h, then the expression decreased gradually to the normal level of.Western-blot showed beta -1,4-GalT-I protein in Liao Intraplasmic injection after LPS 2H expression increased to 3 d after the operation of beta -1,4-GalT-I protein expression is still high 3, the expression of D decreased; the expression of Gal beta 1-4GlcNAc sugar chain is also increasing, in the postoperative effect of 12-24 h -1,4- beta galactosyl enhanced obviously. In addition, the pathological process of PD rats, beta -1,4-GalT-I and Gal beta 1-4GlcNAc sugar chain located mainly in activated microglial cells.
(3) LPS induced by co culture increased -1,4-GalT-I protein expression of beta cells, 8-18 expression of H reached the peak, then gradually decreased to normal level. Immunofluorescence showed that LPS induced cell co culture of microglial activation and fine phagocytosis, and this effect can be reduced.ELISA beta -1,4-GalT-I antibody -1,4-GalT-I antibody showed that beta effect due to LPS the TNF- alpha release.
Conclusion: (1) beta -1,4-GalT-I and its Gal beta 1-4GlcNAc sugar chain may be involved in LPS induced inflammatory response in the central nervous system, especially in the process of migration of inflammatory cells to inflammatory sites.
(2) during the inflammatory response of the central nervous system, TNF- alpha may be involved in the changes in the expression of beta -1,4-GalT-I.
(3) in the inflammatory reaction of central nervous system, beta -1,4-GalT-I may participate in the activation of microglia, and play an important role in the pathogenesis of neurodegenerative diseases.

【學位授予單位】：南通大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2009
【分類號】：R392

【共引文獻】

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本文編號：1380302