本文關(guān)鍵詞：HBV前S2單克隆抗體的制備及生物學(xué)特性研究　出處：《重慶醫(yī)科大學(xué)》2008年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

  更多相關(guān)文章： HBV PreS2 原核表達(dá) 蛋白純化 雜交瘤 單克隆抗體

【摘要】： 目的:研究表明,HBV前S2具有PHSA受體,可介導(dǎo)HBV病毒顆粒吸附到肝細(xì)胞表面,在乙型肝炎入侵肝細(xì)胞中發(fā)揮重要作用,前S2蛋白上含有多個(gè)特異性T、B淋巴細(xì)胞結(jié)合位點(diǎn),能引起中和抗體和保護(hù)性免疫的發(fā)生。因此,本研究首先擬構(gòu)建含乙型肝炎病毒(HBV)PreS2基因的原核表達(dá)載體并在大腸桿菌中高效表達(dá),獲得純化的PreS2融合蛋白,并對(duì)其性質(zhì)進(jìn)行鑒定。然后利用雜交瘤技術(shù)制備小鼠抗乙型肝炎病毒PreS2的單克隆抗體。作為進(jìn)一步研究乙型肝炎病毒PreS2生物學(xué)功能以及PreS2在HBV感染中作用的工具。為預(yù)防和治療乙型肝炎提供新的思路。 方法: 1.采用PCR法擴(kuò)增含Bgl II與SalⅠ酶切位點(diǎn)的PreS2基因片段,原核表達(dá)載體pGST-MOLUC及PCR產(chǎn)物經(jīng)雙酶切后,用T4DNA連接酶將兩者連接并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌JM109構(gòu)建并篩選重組質(zhì)粒。隨后將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入表達(dá)宿主菌BL21感受態(tài)細(xì)胞,經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá),對(duì)表達(dá)蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析和Western-blot檢測(cè)。以谷胱甘肽-Sepharose 4B凝膠為填料進(jìn)一步采用親和層析純化融合蛋白。 2.用PreS2融合蛋白作為抗原免疫Balb/c小鼠,采用雜交瘤技術(shù),制備抗PreS1的單克隆抗體,用ELISA方法來篩選能分泌抗PreS2單克隆抗體的陽性雜交瘤細(xì)胞克隆,采用間接ELISA方法和Western-blot進(jìn)行mAb特異性鑒定;同時(shí)采用間接ELISA方法鑒定mAb的Ig亞類,檢測(cè)mAb的效價(jià)及相對(duì)親和力,并進(jìn)行mAb結(jié)合表位分析。并對(duì)其染色體進(jìn)行分析。 結(jié)果: 1.用PCR方法擴(kuò)增出與預(yù)期大小一致的目的基因片段。重組質(zhì)粒經(jīng)雙酶切鑒定及測(cè)序分析證實(shí)重組質(zhì)粒克隆成功,命名為pGST PreS2。轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主菌后成功誘導(dǎo)出分子量為33kD的GST PreS2融合蛋白,與預(yù)期分子量相符,誘導(dǎo)表達(dá)融合蛋白約占總菌蛋白的10%左右。Western-blot檢測(cè)表明誘導(dǎo)表達(dá)的融合蛋白能與抗GST的單抗發(fā)生特異性結(jié)合。采用谷胱甘肽-Sepharose 4B凝膠純化融合蛋白,純化蛋白純度約為90%左右。 2.成功篩選出兩株可分泌特異性mAb的雜交瘤細(xì)胞7A61和5E73,其抗體亞類為IgG1;將生長(zhǎng)良好的雜交瘤細(xì)胞接種到預(yù)處理的Balb/c小鼠腹腔中制備腹水型PreS2的單克隆抗體,酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)證明腹水效價(jià)可達(dá)10-7; Western-blot結(jié)果鑒定提示該單克隆抗體可以特異的結(jié)合PreS2。ELISA相加實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示2株mAb識(shí)別不同的抗原表位。 結(jié)論:綜上所述,我們運(yùn)用重組DNA技術(shù)與原核表達(dá)方法獲得了PreS2融合蛋白,并對(duì)其進(jìn)行了純化,制備了PreS2單克隆抗體。為我們進(jìn)一步探討乙型肝炎病毒PreS2的生物學(xué)功能及其在HBV感染中的作用奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。為預(yù)防和治療乙型肝炎提供了新的思路。
[Abstract]:Objective: to study that PHSA preS2 has PHSA receptor, which can mediate the adsorption of HBV virus particles to the surface of hepatocytes and play an important role in hepatitis B invading hepatocytes. Pres 2 protein contains many specific T T B lymphocyte binding sites, which can induce neutralizing antibody and protective immunity. In this study, a prokaryotic expression vector containing hepatitis B virus (HBV) preS2 gene was constructed and highly expressed in Escherichia coli to obtain the purified PreS2 fusion protein. The monoclonal antibody against hepatitis B virus PreS2 was prepared by hybridoma technique. As a further study, the biological function of hepatitis B virus PreS2 and Pre were studied. S2 is a tool for the role of HBV infection. It provides new ideas for the prevention and treatment of hepatitis B. Methods: 1. The PreS2 gene fragment containing the restriction sites of Bgl II and Sal 鈪，

本文編號(hào)：1379696