本文關鍵詞：皮質星形膠質細胞細胞因子不對稱分布的研究　出處：《汕頭大學》2008年博士論文　論文類型：學位論文

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【摘要】： 以往的研究表明IL-6等細胞因子在大腦皮層和海馬呈不對稱分布。盡管腦不對稱已為人們廣泛深入的研究,但目前為止,細胞因子在皮質的不對稱分布的細胞學來源仍然只是明確為來自神經(jīng)膠質細胞。由于神經(jīng)膠質細胞對炎癥損傷的免疫功能在兩側大腦半球是不對稱分布的,那么,細胞因子在皮質的不對稱分布來自何種膠質細胞?帶著這個問題,我們研究了在神經(jīng)膠質細胞中數(shù)目最多,分布最廣,擔負了神經(jīng)膠質細胞的大部分功能的星形膠質細胞。用LPS刺激體外培養(yǎng)的小鼠左、右側皮質星形膠質細胞,分別從蛋白水平檢測其分泌IL-6、TNF-α和IL-1-β的情況,實驗分別對新生BALB/c小鼠左、右兩側大腦皮質的星形膠質細胞分組體外培養(yǎng),LPS刺激24h,對照左、右側無LPS刺激組。結果表明,LPS刺激后的左側皮質星形膠質細胞分泌的培養(yǎng)上清中IL-6水平較右側高,兩者有顯著性差別(p0.05)。并對兩側有差別的因子IL-6用RT-PCR的方法來分析mRNA的表達情況。用半定量RT-PCR檢測左、右兩側皮質星形膠質細胞分泌IL-6在基因水平上的不同。結果表明左側皮質膠質細胞的IL-6mRNA水平顯著高于右側(p0.05)。炎癥因子作用下大腦皮質膠質細胞分泌的IL-6在蛋白和mRNA水平均有顯著性差異。關于LPS的識別受體,目前多認為TLR4、CD14和MD-2分子三者構成了“LPS的識別受體復合體”,實驗結果發(fā)現(xiàn)LPS刺激24h的小鼠左側皮質星形膠質細胞分泌的IL-6水平顯著高于右側,那么左、右側皮質星形膠質細胞對LPS的識別受體TLR4、CD14和MD-2分子是否也存在不對稱性呢?帶著這個問題,我們檢測了小鼠左、右側皮質星形膠質細胞經(jīng)LPS誘導后TLR4/ MD-2、CD14分子的表達情況,發(fā)現(xiàn)CD14分子顯著上調(diào),右側較左側及無LPS刺激對照組有顯著升高,p0.01;而TLR4/ MD-2分子顯著下調(diào),與無LPS刺激對照組相比p0.01。此外,應用人流感病毒H1N1和禽流感病毒H5N1感染人神經(jīng)膠質細胞并對照LPS刺激組觀察IL-6、TNF-a、IL-1β等細胞因子的表達情況,發(fā)現(xiàn)流感病毒和LPS刺激均可引起IL-6、TNF-a、IL-1β等炎性細胞因子mRNA的表達量增強。 方法 取新生BABL/c小鼠(24 h),斷頭處死。去除腦膜,分離左、右兩側大腦皮質,制備神經(jīng)膠質細胞。純化分離星形膠質細胞,免疫組化鑒定。LPS刺激24h,設對照組(不加LPS刺激)。ELISA法檢測IL-6、TNF-a、IL-1的水平。應用Trizol試劑,提取星形膠質細胞總RNA,合成cDNA。PCR反應,產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖(AG ,agarose)凝膠電泳,在凝膠成像分析系統(tǒng)進行拍照和圖像分析。LPS刺激的星形膠質細胞和對照組細胞分別加入FITC-Conjugated Anti-mouse CD14 2ul和PE-Conjugated Tol-like receptor 4/ MD-2,設同型對照管,流式細胞儀檢測。流感病毒H1N1、H5N1亞型感染人皮質神經(jīng)膠質細胞。Trizol作用后,收集至離心管中提取細胞總RNA,合成cDNA。PCR反應,PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖(AG ,agarose)凝膠電泳,在凝膠成像分析系統(tǒng)進行拍照和圖像分析。 結果 一、神經(jīng)膠質細胞的形態(tài)學觀察和星形膠質細胞的鑒定 1.在倒置顯微鏡下,原代培養(yǎng)9d的皮質膠質細胞,胞突豐富,分支較多而形態(tài)呈多邊形,主要包括:星形膠質細胞,小膠質細胞和少突膠質細胞。培養(yǎng)過程中給予定軌搖床重復搖晃培養(yǎng)瓶,將培養(yǎng)液移至新培養(yǎng)瓶中,10-20min小膠質細胞貼壁,棄上清,繼續(xù)培養(yǎng)。第20d的皮質星形膠質細胞,在倒置顯微鏡下可見多數(shù)胞體呈星形,核大呈圓形或橢圓形,由胞體伸出許多呈放射狀走行的突起形態(tài)。 2.免疫細胞化學結果顯示:細胞爬片上,凡胞漿被DAB染上棕黃色的細胞均為星形膠質細胞。隨機對5個顯微鏡視野中細胞計數(shù),發(fā)現(xiàn)98%以上的細胞胞漿GFAP蛋白表達陽性,而陰性對照片中,成纖維細胞的胞漿無此著色。表明經(jīng)差速貼壁30min可以很好地去除成纖維細胞;給予定軌搖床重復搖晃培養(yǎng)瓶,可得到純度很高的星形膠質細胞 二、LPS對左、右兩側星形膠質細胞培養(yǎng)上清中IL-6含量的影響 LPS作用24h后,左、右兩側星形膠質細胞培養(yǎng)上清中IL-6的含量明顯升高,與對照組相比差異具有顯著性(p0.05);左側星形膠質細胞培養(yǎng)上清中IL-6顯著高于右側星形膠質細胞(p0.05);左、右兩側對照組相比,差異無顯著性(p0.05)。兩側皮質星形膠質細胞分泌的TNF-a較無LPS刺激的對照組有顯著升高,左側實驗組高于左側對照組,p0.01;右側實驗組高于右側對照組,p0.05。左側和右側實驗組未見顯著差別,p0.05。LPS刺激6h和24h的情況下,星形膠質細胞分泌的IL-1在實驗組較對照組均有較大提高,但左側和右側實驗組及對照組均無顯著性差別,p0.05。 三、LPS對左右兩側星形膠質細胞IL-6 mRNA表達水平的影響 以IL-6和β-actin光密度值的百分比來反映各組IL-6 mRNA的轉錄水平。RT-PCR結果顯示:與control組相比,LPS刺激的左側組及右側組培養(yǎng)星形膠質細胞IL-6 mRNA的表達水平明顯增高(p0.05),左側組顯著高于右側組(p0.05)。 四、TLR4/MD-2在兩側皮質星形膠質細胞的表達 無LPS刺激的對照組TLR4/MD-2的陽性細胞率較低,LPS刺激可下調(diào)表達TLR4/MD-2的陽性細胞率,兩側實驗組陽性細胞率均下降,與無LPS刺激對照組相比p0.01,兩側實驗組膜受體TLR4/MD-2的下調(diào)無差別p=0.792。 五、CD14在兩側皮質星形膠質細胞的表達 LPS刺激右側星形膠質細胞C14陽性細胞率較左側及對照組有顯著升高,p0.01。表明LPS可上調(diào)膜受體CD14在皮質星形膠質細胞的表達,右側皮質星形膠質細胞較左側對LPS的刺激有更高的敏感性。 六、流感病毒H1N1和H5N1亞型感染人神經(jīng)膠質細胞 LPS誘導和人流感病毒H1N1和禽流感病毒H5N1亞型感染人神經(jīng)膠質細胞,均可促進炎性細胞因子IL-6、TNF-a和IL-1βmRNA的表達量增強。 結論 1.經(jīng)差速貼壁30min可以很好地減少成纖維細胞的生長;小膠質細胞培養(yǎng)過程中加入少量星形膠質細胞后可促進小膠質細胞的生長、分化;給予定軌搖床重復搖晃培養(yǎng)瓶,可得到純度較高的星形膠質細胞。 2. LPS誘導24h,左側星形膠質細胞釋放IL-6水平顯著高于右側。左、右側星形膠質細胞釋放TNF-a均顯著高于無LPS誘導組,但左、右側無差別。釋放IL-1β的含量也較無LPS誘導組明顯升高,但無統(tǒng)計學意義,左、右側無差別。 3. LPS誘導的左側星形膠質細胞IL-6 mRNA表達水平顯著高于右側。 4.無LPS誘導的新生小鼠左、右側星形膠質細胞在蛋白和mRNA水平均表達較低水平的IL-6。 5. LPS誘導,可下調(diào)TLR4/MD-2在皮質星形膠質細胞的表達;右側皮質星形膠質細胞的膜受體CD14水平上調(diào)顯著高于左側。 6. LPS誘導、人流感病毒H1N1和禽流感病毒H5N1亞型感染人神經(jīng)膠質細胞,均可促進炎性細胞因子IL-6、TNF-a和IL-1β的mRNA表達量增強。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：汕頭大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2008
【分類號】：R392

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